第二篇细胞的遗传物质 第三章基因表达的分析技术 生物性状的表现均是通过基因表达调控实现的。对基因结构与基因表达调控进行研究，是揭示生命本质的必经之路。在基因组研究的过程中，逐步建立起一系列行之有效的技术。针对不同的研究内容，可建立不同的研究路线。第一节 PCR技术聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术是一种体外核酸扩增技术，具有特异、敏感、产率高、快速、简便等突出优点。PCR技术日斟完善，成为分子生物学和分子遗传学研究的最重要的技术。应用PCR技术可以使特定的基因或DNA片段在很短的时间内体外扩增数十万至百万倍。扩增的片段可以直接通过电泳观察，并作进一步的分析。一、实验原理PCR是根据DNA变性复性的原理，通过特异性引物，完成特异片段扩增。第一，按照欲检测的DNA的5和3端的碱基顺序各合成一段长约1824个碱基的寡核苷酸序列作为引物（primer）。引物设计需要根据以下原则：引物的长度保持在1824bp之间，引物过短将影响产物的特异性，而引物过长将影响产物的合成效率；GC含量应保持在4560%之间；5和3端的引物间不能形成互补。第二，将待检测的DNA变性后，加入四种单核苷酸（dNTP）、引物和耐热DNA聚合酶以及缓冲液。通过95变性，在进入较低的温度使引物与待扩增的DNA链复性结合，然后在聚合酶的作用下，体系中的脱氧核苷酸与模板DNA链互补配对，不断延伸合成新互补链，最终使一条DNA双链合成为两条双链。通过变性（9295）复性（4060）引物延伸（6572）的顺序循环20至40个周期，就可以得到大量的DNA片段。理论上循环20周期可使DNA扩增100余万倍。二、PCR技术的分类及其应用范围1逆转录PCR 逆转录PCR（RT-PCR）是将RNA反转录和PCR结合而建立起来的一种PCR技术。其包括两个过程：通过逆转录合成cDNA和对之进行PCR扩增。其中，用于逆转录的RNA模板要求完整，并且不含DNA和蛋白质等杂质。逆转录PCR可以检测低于10个拷贝的特异RNA。2原位PCR 原位PCR技术（in situ PCR）是将检测细胞内特定基因的原位杂交技术和聚合酶链式反应(PCR)法相结合的方法。它是扩增组织切片或细胞内微量的基因，并将其检测出来的技术。3甲基化PCR 甲基化PCR与常规PCR在原理上一致，但在引物的设计以及DNA样本的处理上有所不同。针对扩增的DNA甲基化区域，一般需要设计三条引物：正常序列引物、甲基化对应引物以及DNA序列修饰引物。通过三组PCR，判断DNA序列中甲基化的存在与否。4实时荧光定量PCR 实时荧光定量PCR（real time quantitative PCR）是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现实时监测整个PCR进程，并能对起始模板进行定量分析。RT-PCR需要荧光探针参与，常用的探针可分为以下几类：1）内掺式染料SYBR Green I；2）序列特异性探针：Taqman， Molecular Beacons， Dual Probes； 3）特异性引物： Amplifluor（Intergen）， Lux引物， Scorpion； 4）阴阳探针。荧光定量PCR不仅可以测定靶DNA的含量，用于临床诊断，而且可以应用不同的探针检测基因突变和SNP分析。5多重引物PCR 多重引物PCR是在同一扩增体系加入多对引物，同时扩增多个基因片段的PCR技术。其技术的优点是通过一次扩增可诊断几种疾病或同一疾病的几个不同的基因突变。6随机引物PCR 多态DNA的随机扩增 （random amplication of polymorphic DNA，RAPD）或随机引物PCR（arbitrarily primed PCR，AP PCR）是应用基因组DNA中单一、随机序列的短引物，通过PCR扩增产生一组代表种或株特性的DNA片段。因此，RAPD是获得种或株的DNA分子指纹图谱的通用方法。7套式PCR 又称巢式PCR，是对靶DNA片段设计两套引物系统，第1套引物扩增1530个循环，再用扩增的DNA片段内设定的第2套引物扩增1530个循环，可使目的DNA序列得到高效扩增。套式引物PCR可减少引物的非特异性扩增，增加特异性扩增,减少PCR的误诊率。8突变体构建PCR（1）应用载体构建突变体的PCR：原理是将野生型目的基因的cDNA插入到克隆载体上，设计携带突变点的一对引物，对克隆载体进行扩增，然后将经过PCR而获得的DNA转染感受态细胞，并用筛选培养基筛选转染的细胞，获得的克隆可以通过细胞扩增，获得大量的携带突变体DNA的载体。（2）应用内外引物构建突变体的PCR：载体构建突变体PCR是构建点突变的高效方法，但不适用于缺失、易位、倒位等突变方式。内外引物构建突变体PCR可以克服载体构建突变体PCR的不足。其原理是合成两对引物，即一对扩增整个cDNA的外引物和一对包含突变序列并部分互补的内引物。分别以一个外引物与一个内引物进行PCR，可以获得两条DNA序列，该两条DNA在突变位点存在部分重合。去除引物，将两条DNA变性，而后进行复性，将可导致两条DNA重合部分互补，并在Taq酶的作用下补齐3末端。用外引物扩增DNA，将获得含有突变的cDNA。PCR引物的设计是PCR成功的关键，必须遵守以下原则：确定扩增区域及其长度；确定引物的值；避免引物自身二聚体、引物间二聚体和发夹结构等二级结构的形成；具有扩增的特异性。三、应用PCR技术检测性别决定基因（一）实验原理SRY基因又称睾丸决定基因（Testis determining factor），位于人类Y染色体，在X染色体上没有相应的同源节段。根据SRY基因序列合成一对特异性引物，通过PCR反应检查患者有无此基因相应扩增片段，以及患者的表型可对患者的真正性别和病因作出判断，另外对胎儿性别的产前诊断有利于防止性连锁遗传病患儿的出生。（二）实验准备1. 材料 人体静脉血、注射器、微量加样器及吸头、1.5ml及0.5ml Eppendorf管。引物序列：（SRY1：5-GATCAGCAAGCAGCTGGGATACCAGTG-3；SRY2：5-CTGTAGCGGTCCCGTTGCTGCGGTG-3）2. 试剂（实验中有关试剂和器材要进行高压灭菌处理）生理盐水、细胞裂解液（50mmol Tris-HCl，pH 8.0；1mmol Na2 EDTA ，pH 8.0；0.5% SDS；0.1mmol NaCl）、10mg/ml蛋白酶K 、20%SDS 、水饱和酚(1mol/L Tris-HCl 抽提)、酚：氯仿：异戊醇（25241）、氯仿：异戊醇（241）、8mol/L 醋酸钾、无水乙醇、70%乙醇、TE（pH8.0）（10 mmol/L Tris-HCl，pH8.0；0.1 mmol/L Na2EDTA，pH8.0）、10buffer（500mmol/L KCl、100mmol/L TrisHCl，pH8.3，室温15mmol/L MgCl2；0.1% 明胶）、4dNTP（1 mmol/LdATP，1 mmol/L dCTP，1 mmol/L dGTP，1 mmol/L dTTP）、Taq 酶（1U/l）、引物溶液（10pmol/l）、5TBE缓冲液（1000ml）（54g Tris碱，27.5g硼酸，20ml 0.5mol/L EDTA，pH8.0）、DNA分子量标记、2%琼脂糖凝胶、载样缓冲液（100ml）（0.2%溴酚蓝，50%蔗糖，10mol/L NaOH 12滴）、10mg/ml溴化乙锭溶液（戴手套谨慎称取溴化乙锭约200mg，放入棕色瓶中，加重蒸水20ml，溶解后置4冰箱保存备用。使用时100ml琼脂糖凝胶中加5l 10mg/ml 溴化乙锭溶液，终浓度为0.5g/ml）。3. 实验仪器 PCR扩增仪、超净工作台、高速台式离心机、电泳仪及电泳槽、紫外检测仪。（三）实验步骤1. DNA模板制备方法：取毛发12根，尽量剪碎，于1520ml生理盐水中100水浴10min，离心取上清备用。方法：外周血提取DNA（1）白细胞的分离抗凝血用12倍的生理盐水或磷酸缓冲的生理盐水（PBS）稀释并混合。在50ml离心管中加入1倍体积淋巴细胞分离液（上海试剂二厂），在上面仔细铺一层2倍体积已稀释的血液。室温以2000rpm离心15min20min，红细胞应沉于管底，而白色的淋巴细胞应分布于上层血浆与下层淋巴细胞分离液的界面。吸弃血浆，小心吸取淋巴细胞层，直至把淋巴细胞转移完全。用生理盐水或PBS洗淋巴细胞二次。最后得到的淋巴细胞沉淀，可立即用于DNA的提取，或冻存于超低温冰箱中，直至使用。（2）DNA的提取（见本篇第一章）。2. PCR反应体系配制及扩增（1）PCR反应总体积50l，取一洁净的0.5ml Eppendorf管，依次加入：10buffer 5ldNTP 5l引物1 2.5l引物2 2.5l模板DNA 10lTaq DNA 2Ud3H2O 补足50l（2）将反应管放入PCR扩增仪上进行聚合酶链反应，条件为94变性10min后，94 45s、55 45s、72 90s共30个循环；最末一个循环紧接72再延伸10min。3. 扩增产物电泳检测取PCR扩增产物10l与2l上样缓冲液混合后，与DNA Marker同时进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结束，取出凝胶置于紫外检测仪上观察。（四）注意事项1. 实验过程应设阴性及阳性模板对照。2. PCR常见问题及解决办法（1）没有得到预期的PCR扩增产物：确证聚合酶的活性是否正常；DNA解链是否充分，变性温度是否准确；引物组成是否正确，有无二级结构组成；反应系统有无蛋白酶或核酸酶存在，使聚合酶或模板及产物降解。（2）有非特异性扩增产物出现：增加复性温度，缩短复性时间及延伸时间；降低引物和Taq DNA聚合酶的用量；调整Mg2+浓度；减少热循环次数。（3）形成了引物二聚体：检查引物的序列，特别是3端是否有互补区；增加引物的长度；调整引物与模板浓度，使模板比例增高，降低引物使用浓度；增加复性温度；减少热循环次数。（4）PCR产物在凝胶电泳中成片状：减少Taq DNA聚合酶的用量；增加复性温度，减少复性时间及延伸时间；降低Mg2+浓度；减少循环次数；从凝胶中回收与预期分子量相同的DNA，再次进行PCR反应。3. 实验安全溴化乙锭是强诱变剂，并有中度毒性，取用含有这一染料的溶液时务必戴上手套，这些溶液经使用后，应进行净化处理。第二节单链构象多态性（SSCP）分析单链构象多态性（singlestrandconformationpolymorphism，SSCP）分析是利用DNA或RNA单链构象具有多态性的特点，结合PCR进行基因检测的一种分析技术，称为PCR-SSCP技术。其基本原理为：DNA或cDNA在变性后，由于序列的不同而导致单链DNA的空间结构各异。在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的过程中，不同空间结构的单链DNA迁移率存在差异。因此，PCR-SSCP可以用来鉴定单核苷酸的差异。该技术已被广泛用于癌基因和抗癌基因变异的检测、遗传病的致病基因分析以及基因诊断、基因制图等领域。PCR-SSCP的敏感性随核苷酸片段长度的增加而降