目录摘要关键字1 前言1.1DNJ 简介1.2HPLC 法简介1.3 国内外研究动态1.4DNJ 的作用和研究意义2 材料与仪器2.1 材料2.2 设备和仪器2.3 试剂3 方法与步骤3.1 桑叶样品的制备3.2DNJ 标准液的配制3.3DNJ 的衍生化3.4 高效液相色谱测定3.5 精密度实验3.6 稳定性实验3.7 重现性实验3.8 回收率实验4 结果4.1 标样高效液相图谱4.2 样品高效液相色谱4.3 标准曲线的制备4.4 精密度实验结果4.5 稳定性实验结果4.6 重现性实验结果4.7 回收率实验结果5 讨论6 结论 参考文献 致谢应用HPLC测定桑叶中DNJ的含量学 生：章珍亭指导老师：唐忠海讲师(湖南农业大学东方科技学院 长沙 410128) 摘要：本实验以桑叶为材料，以 0.05mol/LHCl 为溶剂提取桑叶中的 1-脱氧野尻 霉素，并用芴基氯甲酸甲酯(FM0C-C1)为衍化剂，在PH8.5的硼酸盐缓冲液 中进行衍生化反应，生成具有紫外吸收的 DNJ-FMOC 的络合物，再用高效液相 色谱-紫外检测法对其分离测定。通过精密度，稳定性，重复性试验，回收率来 确定桑叶中DNJ的含量。结果表明，反应产物的色谱图分离效果良好DNJ-FMOC 的峰面积与DNJ浓度呈高度正相关关系，加样回收率平均为101.4%。精密度试验、 稳定性试验、重现性试验、回收率试验表明，该方法稳定可靠，可以作为测定桑叶 中DNJ含量的有效方法。关键词：高效液相色谱；1-脱氧野尻霉素；精密度；稳定性；重复性；回收率Determination of DNJ in Morus alba L.leaves byHPLCStudent:Zhang ZhentingTutor:Tang Zhonghai(Orient Science and Technology College of Hnnan Agricultural University,Changsha 410128,China)Abstract:In this experiment， 1-deoxynojirimycin(DNJ) in the mulberry leaf powderwas extracted with 0.05mol/LHCl，then itwas derived by fluorenyl methyl(FMOC)in pH 8.5 borate buffer solution . DNJ-FMOC came into being complex compound， which can be detected by ultraviolet，We separated and detected it by UV-HPLC.The result indicated that the product was separated entirely.There are the most positive relevance between the peak area of DNJ-FMOC and the concentration of DNJ.The average recovery ratio of adding sample is 101.4%. The precision experiment，stability experiment，repeatability experiment and recovery rate experiment showed that the method is credible，so it can be used as an efficient method to detect DNJ content in the mulberry.Key words: High Performance Liquid Chromatography; 1-Deoxynojirimycin；precision;Stability; repeatability; recovery rateA -XX.-JL.1 前言:1.1DNJ 简介DNJ(1-脱氧野尻霉素)是一种哌啶生物碱，其化学名称是3,4,5-三羟基-2-羟 甲基四氢吡啶。是1-Deoxynojirimycin的缩写。分子式是C6H13NO4，分子量 为 1634。现代药理研究表明，桑叶中的多羟基生物碱类成分具有显著的降血糖 作用，其中1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojirmycin,DN J)是最有潜力的一种糖苷酶抑 制剂5，通过抑制酶分解淀粉和糖，并阻止葡萄糖的吸收，从而降低血糖水平6,7。 野尻霉素(nojirimycin)首先由Inoue等作为抗生素从链霉菌中得到的，DNJ是由 野尻霉素氢化得到的。DNJ的来源有两大类：植物来源和微生物来源。植物来源 包括桑叶及桑根皮，野砣草(Commelina communis),风信子(H yacinthus orientalis)， 沙参属植物(Adenophora triphylla var.japonia)，爵床科植物(Jacobinia suberecta)。 微生物来源包括浅紫灰链霉菌GC-148(Streptomyces LavendulaeGC-148)和芽抱杆 菌(Bacillus)。目前对DNJ的检测方法主要有高效液相色谱法(荧光检测，蒸发 光散射检测)和气相色谱法。1.2HPLC 法简介高效液相色谱法的灵敏度高，但高效液相色谱法灵敏度不及气相色谱法且 同时存在柱外效应。而用气相色谱法测 DNJ 的技术还不十分成熟。在提取分离 的技术上，前人进行了很多的探索，最终却都只是初步纯化，未得到真正的 DNJ 的纯品，在定性定量的检测方面，从普通分光光度计发展到利用HPLC，将柱前 衍生和荧光检测相结合，精度得到了很大的提高。高效液相色谱法是色谱法的一 个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂 或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成 分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。该方法已成为化学、 医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。高效液相色 谱法有“三高一广一快”的特点：高压：流动相为液体，流经色谱柱时受到的阻 力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对载液加高压。高效：分离能效高。可选 择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高 出许多倍。高灵敏度：紫外检测器可达0.01ng，进样量在uL数量级。应用范围 广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是在对沸点高、 大分子、强极性、热稳定性差的化合物的分离分析时，显示出优势。分析速度快、 载液流速快：较经典液体色谱法速度快很多，通常分析一个样品在 15 至 30 分钟， 有些样品甚至在 5 分钟内即可完成，一般小于 1 小时。此外高效液相色谱还有色 谱柱可反复使用、样品不被破坏、容易回收利用等优点。但也存在缺点，与气相 色谱法相比各有所长，相互补充，高效液相色谱法的缺点是有“柱外效应”。在 从进样到检测器之间，除了柱子以外的任何死空间（进样器、柱接头、连接管和 检测池等）中，如果流动相的流型有变化，被分离物质的任何扩散和滞留都会显 著的导致色谱柱的加宽，柱效应降低。高效液相色谱检测器的灵敏度不及气相色 谱。1.3国内外研究动态目前国外尤其是日本和韩国对桑叶的有效成分研究较多，发现其中有效成分 DNJ 具有降血糖等作用。我国仅有少数一些学者对桑叶生物碱 DNJ 进行过研究， 对 DNJ 的提取检测工艺研究较少。目前对 DNJ 的检测方法主要有高效液相色谱 法（荧光检测，蒸发光散射检测）和气相色谱。不同的研究者应用不同的检测设 备建立了相应的检测方法8。对于DNJ的提取检测方法，杨海霞采用蒸馏水提取法。提取了桑叶中的DNJ, 然后利用阳离子交换柱层析对 DNJ 进行了初步纯化，最后用分光光度法测定桑 叶中DNJ的含量9。这是DNJ提取分离中最初的方法，只对DNJ进行了初步分 离，并且用分光光度法测量DNJ含量，精确度不高。姜永涛等在2005年采用去离子水煎煮法，提取桑叶中的DNJ，然后再用732 （H+型）离子交换树脂对DNJ进行初步纯化，最后采用高效液相色谱法，使用 氨基分析柱和蒸发光散射检测器（ELSD）对桑叶及蚕沙中DNJ进行了检测10。欧阳臻等在2005年采用0.05mol/L盐酸提取桑叶干粉末中的DNJ，在pH8.5 的硼酸盐缓冲液条件下，用 RMOC-CI 与 DNJ 反应生成荧光产物，然后用高效 液相色谱-荧光检测器测定DNJ的含量11。刘卫旗，朱祥瑞在 2006年同样采用蒸馏水提取桑叶、桑枝木质部中的 DNJ， 之后采用732（H+型）离子交换树脂对DNJ进行初步纯化，但最后采用的是 HPLC-PDA法对DNJ进行分析测定12。此法比较上述分光光度法较精确。李宇亮等在2006年研究了从桑叶中提取分离DNJ,探讨了提取剂，提取方 法，料液比，提取次数，时间等因素对提取率的影响。实验得到了提取的最佳条 件：以65的乙醇为提取剂，按料液比1：8 和1：4，超声强化细胞破碎20 分 钟（功率1800W）,732H阳离子树脂分离,0.25mol/L氨水洗脱（速度12mol/min） 13。李宏等在 2006 年为了快速测定桑叶中的 DNJ 的含量,利用化学合成法将 DNJ 转化为沸点较低的脂类物质,并首先建立了用气相色谱法快速检测 DNJ 的 新方法14。张作法等在2006 年测定桑叶中 DNJ 含量时,采用的是盐酸,超声波提取, RMOC-CI标记，用配有荧光检测器的反相高效液相色谱法检测DNJ的含量。马静等提出可采用煎煮法,浸渍法,渗漉法,超声法和回流法等方法进行DNJ的提取，同时提出可采用大孔树脂吸附法，高效逆流色谱技术，超声波萃取 技术,超临界萃取法等方法来进一步的分离纯化16。这些均有很好的借鉴作用。经过前人的不断探索，不论是对DNJ的提取分离还是对DNJ的定性定量检 测方面都取得了很大的进步。1.4DNJ 的作用和研究意义目前，全球的糖尿病患者已达1.5亿，并且数目还在增长。现在已经仅次于心 血管病，癌症的第三致死疾病 17，因此预防和治疗糖尿病，药物研究和开发引 起了众多专家及医疗结构的高度重视。而DNJ的作用主要有：DNJ对a-葡萄糖 苷酶的抑制作用：DNJ是所有哺乳动物a-葡萄糖苷酶的有效抑制剂，它能通过 降低碳水化合物的消化和葡萄糖的吸收来降低食后高血糖。由于这一特性， DNJ 可治疗糖尿病的发作，肥胖症和相关的机能紊乱。Kimura等18在2007年通过实 验表明 DNJ 浓缩粉比直接服用桑叶粉抑制食后高血糖作用好得多。因此可开发 DNJ 浓缩粉，作为食品补充剂，预防糖尿病。 DNJ 对病毒的抑制作用：有报道 发现 DNJ 对病毒的活性有抑制作用，有显著的抗逆转酶病毒活性19,20，具有抗 人艾滋病病毒HIV作用。体外实验表明，艾滋病的病原体HIV是借助外膜糖蛋 白（gp120）附着于T辅助细胞的CD4细胞受体上，通过细胞融合形成合胞体启 动感染环的。由于桑白皮的有效成分1-脱氧野尻霉素是a -葡萄糖苷酶的抑制剂, 可干扰gp120 一侧链多聚糖结构的合成，从而阻断gp120和CD4之间的结合， 减少或阻止合体细胞形成，减弱HIV的感染力。最近报道有两种新的抗HIV药 为DNJ的衍生物：N-壬基-脱氧野尻霉素DNJ和N-壬基-脱氧半乳糖野尻霉素 DGJ。N-壬基-DNJ是葡糖糖苷酶抑制剂，在其作用下，病毒糖蛋白