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实验教学教案首页本次实验项目:肝脏谷丙转氨酶活力测定本次实验课时:验证性4学时教学要求:1. 掌握实验原理,了解转氨酶的性质及临床意义2. 掌握谷丙转氨酶活力的测定方法重点:实验原理、转氨酶的转氨基作用。教学手段及教具:课堂讲授,学生实验操作。讲授内容及时间分配:课堂讲授1 .相关知识0.1学时2. 实验目的0.1学时3. 实验原理 0.3学时4. 实验操作0.2学时实验教学肝脏谷丙转氨酶活力测定实验的操作技术3学时参考资料生物化学实验肝脏谷丙转氨酶活力测定(验证性)相关知识1 .酶的提纯基本操作程序及基本原则2. 酶的活力单位(IU)的定义及酶活力的测定(酶的定量测定)3. 测定酶活力一般经如下几个步骤 选择适宜的一定浓度的底物。 确定酶促反应的条件。优化条件 将一定量的酶液和底物溶液混合,确定反应时间(因要测定酶促反应初速度)。 反应到一定时间后取出反应液终止反应。 测定产物的生成量。 计算酶活力、酶的比活力。4. 酶的比活力一一表示酶纯度的指标每单位酶蛋白所含的活力单位数。对固体酶:比活力=活力单位/mg酶蛋白对液体酶:比活力=活力单位/ml酶液比活力越大,酶的活力越大,含酶量或有活性的酶量越多。5. 总活力、纯化倍数和回收率6. 酶活力测定方法一不同酶选用不同的方法7. 氨基酸转氨基作用、联合脱氨基作用COOHRICHNH2COOH 仃一氨基酸转氨酶虬互=0 CCCCOOH口一酮戊二酸nh3+nadh+h ,或 nadph+h+L-谷氨酸脱氢酶8 .谷丙转氨酶及临床意义:查肝功为什么要抽血化验转氨酶指数呢?谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶*ST, GOT)是人体内糖和蛋白质互相转变所需的酶+ 人再生体内分布广泛。ALT的分布以肝中最高,主要存在于肝细胞浆中,AST存在于肝细胞浆 和线粒体内。其次是肾)。心、骨骼肌、脾等。扁的分布则以心肌最高,其次为肝、骨骼肌、 肾脏等。 谷丙转氨酶为细胞噂,血清中活性很低,各组织器官中以心和肝的活性最高。当某种 原因使细胞膜通过性f,转氨酶可大量释放入血液,血清中转氨酶活性ffo 抽血化验若转氨酶比正常水平偏高则有可能肝组织受损破裂,肝细胞的转氨酶进入血液。(结合乙肝抗原等指标进一步确定是什么原因引起的) 常作为疾病诊断、观察疗效和预后的指标:急性肝炎:S-GPT ff、S-GOT f心肌梗塞:S-GOTff一、实验目的1. 了解转氨酶的性质及临床意义2. 掌握谷丙转氨酶活力的测定方法二、实验原理联合脱氨基作用是大多数氨基酸的主要代谢方式,通过转氨基作用与谷氨酸氧化脱氨基 作用偶联而完成。丙氨酸及a 一酮戊二酸为谷丙转氨酶的作用底物,利用内源性(肝细胞已 有的)磷酸毗哆醛作辅酶,在一定条件下及时间作用后测定所生成的丙酮酸的量来确定酶活 力。丙酮酸能与2,4-二硝基苯肼结合,生成丙酸一2,4二硝基苯腙,后者在碱性溶液中呈现 棕色,其吸收光谱的峰为439530nm,可用于测定丙酮酸的含量。a 酮戊二酸也能与2,4- 二硝基苯肼结合,生成相应的苯腙,但后者在碱性溶液中吸收光谱为与丙酸-2,4二硝基苯腙 的吸光度有差别,在520nm波长比色时,丙酮酸一2,4二硝基苯腙吸光度高出3倍。在520nm 处吸光度增加的程度与反应体系中丙酮酸与a 酮戊二酸的摩尔比基本上呈线性关系,故可 以测定谷丙转氨酶的活力。谷丙转氨酶(简称GET、ALT,在血清中的正常值是5(0)40U/L以内)催化反应:丙氨酸 + a -酮戊二酸 丙酮酸+ 谷氨酸COOHCH3R丙氨酸ch3 GTPCOOH ”一氨基酸 丙酮酸 虱酶%;一CCCCOOH口一酮戊二酸nh3+nadh+h* 或 nadph+h+L-谷氨酸脱氢酶三、 实验器材、试剂、材料COOH / (一) 材也口新鲜猪肝脏、I / H2O+NAD+或NADP+(二)器材722型分光光度计、剪刀、吸管、玻璃均浆器(三)试剂OHCH21 .标准丙酮酸溶液(1ml相当于500ug);准确称取纯化丙酮酸钠62.5mg,溶于100ml0.5mol/LH2S04中,临用前配制。HN%2 .谷丙转氨酶底物;称取L-丙氨酸0.90g及a -酮戊二酸29.2mg,先溶于pH7.4 0.1mol/L磷酸缓冲液中,然后用1 mol/LNaOH调至pH7.4,再用pH7.4 0.1mol/L磷 酸缓冲液稀释至100ml,贮藏于冰箱内驰保存一周。3. 0.1mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4);称取 13.97g K2HPO4 和 2.69g KH2PO4 溶于 1000ml 蒸 馏水中。4. 0.02%2,4二硝基苯肼;称取2,4-二硝基苯肼20mg溶于少量1 mol/L HCl中,加热 溶解后,用1 mol/L HCl稀释到100ml。5. 0.4mol/L NaOH溶液 6 .生理盐水四、实验操作步聚准备工作:打开水浴锅恒温37度;722E型分光光度计通电预热。1. 肝匀浆制备(每四组做1份,共用)将鸡肝脏用生理盐水冲洗,滤纸吸干,称取肝脏0.25g,剪成小块,置于玻璃匀浆管内(或小研砵中),加入2.25ml预冷的pH7.40.1%mol/L磷酸缓冲液,制成10%肝 匀浆。吸取肝匀浆0.1ml于另一试管中,加入预冷的0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)4.9ml 摇匀,为稀释肝匀浆(稀释50倍)。2.谷丙转氨酶活力测定(每组做1份) 取试管4支按下表加液测定管标准管对照管空白管谷丙转氨酶底物/ml0.50.5-混匀后,37C水浴准确保温5分钟稀释肝匀浆/ml0.1-0.1-标准丙酮酸-0.1-水-0.1混匀后,37C水浴准确保温30分钟2,4 -二硝基苯肼/ml0.50.50.50.5谷丙转氨酶底物/ml-0.50.5混匀后,37C水浴准确保温30分钟0.4mol/L NaOH5.05.05.05.0i争止10分钟A520谷丙转氨酶活力单位:规定酶在37与底物作用30min后,能产生2.5ug的丙酮酸为一个谷 丙转氨酶活力单位。五、实验结果与讨论1. 谷丙转氨酶活力计算基础:规定酶在37C与底物作用30min后,能产生2.5ug的丙酮酸 者为一个谷丙转氨酶活力单位。2. 测定管一对照管的吸光度值,与标准管相比算出其相当于丙酮酸含量。3. 根据公式计算:(注意稀释倍数,理解公式) 每毫升稀释肝匀浆谷丙转氨酶活力单位: 每克肝脏谷丙氨酶的活力单位。4 .计算出比活力比活力=活力单位/ml酶液六、注意事项1 .分析(列表)各管与计算实验结果(OD值)相关的物质成分。管别各管与实验结果有关的呈色反应的物质来源空白管2,4 -二硝基苯肼+ ?标准管2,4 -二硝基苯肼+ ?2,4 -二硝基苯肼+ ?对照管2,4 -二硝基苯肼+ ?2,4 -二硝基苯肼+ ?2,4 -二硝基苯肼+ ?测定管2,4 -二硝基苯肼+ ?2,4 -二硝基苯肼+ ?2,4 -二硝基苯肼+ ?2,4 -二硝基苯肼+ ?
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