细胞培养常见问题及其解决1. 如何选用特殊细胞系培养基？培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在 MEM 中培养的细胞，很可能在 DMEM 或 M199 中 同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开 始。2. 何时须更换培养基？视细胞生长密度而定， 或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。3. 可否使用与原先培养条件不同之培养基？不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基， 若骤然使用和原先提供之培养条件 不同之培养基， 细胞大都无法立即适应， 造成细胞无法存活。4 可否使用与原先培养条件不同之血清种类？不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产 生极大的影响。来自不同物种的血清， 在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使 用错误常会造成细胞无法存活。5 何谓 FBS, FCS, CS, HS ?FBS (fetal bovine serum)和FCS (fetal calf serum)是相同的意思，两者都是指胎牛血清，FCS乃 错误的使用字眼， 请不要再使用。 CS (calf serum) 则是指小牛血清。 HS (horseserum) 则是指马 血清。6培养细胞时应使用5 %或10% CO2?或根本没有影响？一般培养基中大都使用 HCO3-/CO32-/H+ 作为 pH 的缓冲系统， 而培养基中 NaHCO3 的含量 将决定细胞培养时应使用的 CO2 浓度。当培养基中 NaHCO3 含量为每公升 3.7 g 时，细胞培养 时应使用10 % CO2；当培养基中NaHCO3为每公升1.5 g时，则应使用5 % CO2培养细胞。7Hanks平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用，不需要CO2培养箱。原因是什么？ Hanks平衡 盐溶液(HBS)和Earles平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别？HBS和EBS的主要差别在于碳酸氢钠的水平，在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L)中高。 碳酸氢钠需用高水平的 CO2 平衡，以维持溶液的 PH 值。 Eagles 液在空气水平的 CO2 中，溶液 会变碱，Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles 液，。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以了。8. 细胞之接种密度为何？ 依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造 成细胞无法生长之一重要原因。9. 悬浮性细胞应如何继代处理？一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中， 稀释细胞浓度即可， 若培养液太多时， 可将 培养角瓶口端稍微抬高， 直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培 养角瓶， 加入新鲜培养基稀释至适当浓度， 重复前述步骤即可。10. 冷冻管应如何解冻？取出冷冻管后，须立即放入37 C 水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在 1 分钟内全部融化，并 注意水面不可超过冷冻管盖沿， 否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时， 必须 注意安全， 预防冷冻管之爆裂。11. 细胞冷冻管解冻培养时， 是否应马上去除 DMSO？除少数特别注明对 DMSO 敏感之细胞外， 绝大部分细胞株(包括悬浮性细胞)， 在解冻之后， 应直接放入含有 10-15ml 新鲜培养基之培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除 DMSO 即 可， 如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。12. 附着性细胞继代时所使用之 trypsin-EDTA 浓度？应如何处理？一般使用之trypsin-EDTA浓度为0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次开瓶后应立即少量分 装于无菌试管中，保存于-0 C，避免反复冷冻解冻造成trypsin之活性降低，并可减少污染 之机会。13. 欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？欲回收动物细胞， 其离心速率一般为 300xg (约 1,000rpm)， 5 - 10 分钟， 过高之转速， 将造 成细胞死亡。14. 细胞冷冻培养基之成份为何？动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意：由于 DMSO 稀释时会放出大量热能， 故不 可将 DMSO 直接加入细胞液中， 必须使用前先行配制完成。15. DMSO 之等级和无菌过滤之方式为何？冷冻保存使用之DMSO等级，必须为Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)， 其本 身即为无菌状况， 第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中， 保存于 4C， 避免反复冷冻 解冻造成 DMSO 之裂解而释出有害物质， 并可减少污染之机会。若要过滤 DMSO， 则须使用耐 DMSO 之 Nylon 材质滤膜。16. 冷冻保存细胞之方法？冷冻保存方法一：冷冻管置于4 C 3060分钟（-20 C30分钟*） -80 C 1618小时（或隔夜） f液氮槽vaporphase长期储存。冷冻保存方法二：冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3 C至-80 C以下，再 放入液氮槽 vapor phase 长期储存。 *-20 C 不可超过 1 小时， 以防止冰晶过大，造成细胞大量 死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80C冰箱中，惟存活率稍微降低一些。17. 细胞欲冷冻保存时， 细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？冷冻管内细胞数目一般为1 x 1 06 cells/ml vial， 融合瘤细胞则以 5x106 cells/ml vial 为宜。18. 培养基中是否须添加抗生素？除于特殊筛选系统中外， 一般正常培养状态下， 培养基中不应添加任何抗生素。19. 应如何避免细胞污染？细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不 当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质 良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。20. 如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？原则上：直接灭菌后丢弃之。当重要的培养污染时，研究者可能试图消除或控制污染。首先，确定污染物是细菌、真菌、支原 体或酵母，把污染细胞与其它细胞系隔离开，用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台，检查 HEPA 过滤器。高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性，因而，做剂量反应实验确定抗生素和抗霉 菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。 下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。1. 在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。2. 分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内，把选择抗生素加 入到每一个孔中。例如，两性霉素B推荐下列浓度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。3. 每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆。4确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度23倍浓度的抗生素的培养液培养细胞23代。5. 在无抗生素的培养基中培养细胞一代。6. 重复步骤 4。7在无抗生素的培养基中培养46代，确定污染是否以已被消除。21支原体（mycoplasma）污染的细胞，是否能以肉眼观察出异状？不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株， 无法以其外观分辨之。22支原体污染会对细胞培养有何影响？支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数， 代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确 认细胞为mycoplasma-free,实验结果之数据方有意义。23. 侦测出细胞株有支原体污染时，该如何处理？直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。24. CO2培养箱之水盘如何保持清洁？定期（至少每两周一次） 以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。25为何培养基保存于4 C冰箱中，颜色会偏暗红色，且pH值会越来越偏碱性？培养基保存于4 C冰箱中，培养基内之CO2会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。而培养 基中之酸碱指示剂（通常为 phenol red） 的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果， 将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时，可以通入无菌过滤之CO2，以调整pH值。26. 各种细胞培养用的dish，flask是否均相同？不同厂牌的 dish 或 flask， 其所 coating 的 polymer 不同， 制造程序亦不同， 虽对大部分细胞 没有太大之影响， 惟少数细胞则可能因使用厂牌不同之 dish 或 flask 而有显著之生长差异。27. 购买之细胞冷冻管经解冻后，为何会发生细胞数目太少之情形？研究人员在冷冻细胞之培养时出现细胞数目太少， 大都是因为离心过程操作上的失误， 造成细 胞的物理性损伤， 以及细胞流失。建议细胞解冻后不要立刻离心， 应待细胞生长隔夜后再更换 培养基即可。28. 购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因？ 研究人员在细胞培养时出现存活率不佳， 常见原因可归纳为：培养基使用错误或培养基品质不 佳。血清使用错误或血清的品质不佳。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后， 加以洗涤细胞和离心。 悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于-0 C太久。30. L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与 蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直 没有最终定论。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。31. GlutaMAX-I是什么？培养细胞如何利用GlutaMAX-I?这个二肽有多稳定？GlutaMAX-I二肽是一个L-谷氨酰胺的衍生物，其不稳定的alpha-氨基用L-丙氨酸来保护。一种 肽酶逐渐裂解二肽，释放L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I二肽溶液有最小的降解， 如果在相同条件下，L-谷氨酰胺几乎完全降解。32. 什么培养基中可以省去加酚红？酚红在培养基中用作 PH 值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明， 酚红可以模拟固醇类激素的作用，（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺 乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不 使用加有酚红的培养基。33. 如何用台盼兰计数活细胞？用无血清培养基把细胞悬液稀释到2002000个/毫升，在0.1毫升细胞悬液中加0.1毫升0.4% 的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝 色细胞是死细胞。34. 培养基中丙酮酸钠的作用是什么？丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没 有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。35二价离子抑制胰蛋白酶活性吗？使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么？二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白 酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前，用EDTA清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离 子。36室温下配制的Tris-HCl溶液，在37C使用时PH值是多少？