基因打靶技术【摘要】基因打靶技术是建立在同源重组技术之上,可对基因组进行定位修饰的 实验方法。本文简述了基因敲除技术的基本原理、打靶策略、筛选机制,在动植 物和微生物中常用的基因敲除方法以及基因打靶的应用。基因敲除技术是研究功能基因作用的重要方法, 是后基因组时代的重要研究内 容。【关键词】基因打靶;同源重组;打靶策略;筛选机制一 前言发展历史：基因敲除(gene knockou t)又称基因打靶(Gene targe ting)是自20 世纪80 年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，。早在80年代 初，人们就开始研究在哺乳动物基因组中，存在使外源DNA与现存同源序列同源重组 的可能性。1985年,Smithies及其同事的研究使之得到确证。同期的相关研究证明了鼠多能 干细胞系具有诱发小鼠产生种系组织的能力，甚至在长期培养后仍存在，导入这些细胞器系的 突变可以传给后代。其传统概念是指同源重组敲除技术即利用DNA转化技术，将 构建的打靶载体导入靶细胞后，通过载体DNA序列与靶细胞内染色体上同源DNA 序列间的重组，将载体DNA定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，或 与靶细胞基因组上某一确定片段置换，从而达到基因敲除的目的5。随着基因 敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功 的有基因的插入突变和RNAi，它们同样可以达到基因敲除的目的。所以，基因 敲除的基本原理是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的一种分子生 物学技术。二 主题1 基因打靶的基本原理绝大多数的基因打靶策略都是基于同源重组(homologous recombination)的机制。同 源重组是指发生在非姐妹染色单体(sister chromatin)之间或同一染色体上含有同源序 列的DNA分子之间或分子之内的重新组合，普遍存在于噬菌体、细菌和真核生物中。基因敲除的操作步骤基因敲除的一般流程见图1,基本程序是：用PCR技术扩增目的基因序列，在体 外插入卡拉霉素、四环素等受体菌原先不具有的抗性标记, 使目的基因失活, 再将失活的目的基因构建至一环状载体上, 用电转化、显微注射等方法将构建 好的载体转化入受体细胞内, 以抗性标记初步筛选阳性菌或进行目的基因功能 的失活检测，再以PCR, southern杂交等做进一步验证。现在，为了更好地区别 单交换与双交换造成的重组, 通常使用两个抗性标记, 在发生单交换时, 阴性和阳性抗性标记都会整合至基因组, 而发生双交换时, 第二次同源重组会导致基因回复至野生型或敲除目的基因, 在前一种情况下, 两种标记都不存在; 在后一种情况下, 基因组上只有阳性标记, 因此这样的敲 除子可以通过正负筛选鉴别出。但如果载体构建时在同源序列内部引入一些突 变, 就不会回复至野生型, 这样, 既能实现 基因的失活, 基因组上又不会带有抗性标记, 这对构建/食品级0的安全菌株是 有益的。几种常用的基因敲除技术1 利用同源重组进行基因敲除基因敲除是在同源重组技术及胚胎干细胞（embryonic st em cell, ES细胞）技 术的基础上逐步完善发展起来，主要是利用DNA转化技术，将含有目的基因和靶基 因同源片段的重组载体导入靶细胞,通过载体与靶细胞染色体上同源序列间的重 组，将外源基因整合入内源基因组内，使外源基因得以表达。通过研究靶细胞或 者个体在目的基因插入前后遗传特性的改变，达到研究基因功能的目的1 。 基因敲除技术已从最初简单的完全敲除发展到条件敲除阶段，现正朝着特定组织 基因敲除、特定时间基因敲除的可调控敲除方向发展。完全基因敲除是通过同 源重组直接将靶基因在细胞或者动物个体中的活性完全消除;而条件基因敲除则 是将某个基因的修饰限制于特定类型的细胞或个体发育特定的阶段，即通过位点 特异的重组系统实现特定基因敲除2 ，现阶段以噬菌体的Cre /Loxp系统和 酿酒质粒的FLP /FRT系统应用得最为广泛3 。2利用随机插入突变进行基因敲除 基因定点敲除虽然是最直接的研究基因功能的方法，但是对开花植物而言，缺乏 高效实用的定点突变技术。目前较为有效的方法是大规模的随机插入突变， 它为 在基因组范围内敲除掉任何一个基因提供了可能。这项技术具有效率高、基因 完全失活、容易分离鉴定被插入引起失活的目的基因等优点。随机插入突变可 以分为T - DNA插入突变和转座子插入突变。以农杆菌介导的T - DNA插入突变 适用于多种植物，可以直接在植物基因组DNA中产生稳定的插入突变，而且插入位 点的随机性较强,但是它只适用于那些容易被T - DNA转化的植物,且常常会引起 的染色体重排现象，使突变体表型与T - DNA插入无关而难以进行遗传学分 析。尽管如此，近年来将T - DNA插入突变应用于拟南芥还是获得了广泛的成功。 4 转座子插入突变是利用了转座子在染色体上可移动的特点，当它跳跃插入 到某个功能基因时,就会引起该基因的失活,并诱导产生突变型。因此可以利用 某些能随机插入基因序列的转座子,在目标细胞基因组中进行随机插入突变,建 立一个携带随机插入突变的细胞库,然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基 因敲除细胞。目前研究报道,能用于任何物种的转座子打靶载体是以两种噬菌体 Mu为基础的mini -Mu转座子（每个转座子上都携带标记基因），它们可以在拟删 除基因两侧各插入一个mini -Mu转座子，然后在两个插入位点之间的制造缺失。 这种缺失可以使两个转座子加上靶区之间的部分基因转移，留下一个带有选择标 记在两侧的与靶基因同源的臂。利用mini - Mu转座子进行基因敲除具有极大的 方便性，它不需要知道基因组序列，仅已知外显子即可，且载体构建迅速，技术简 单，载体可以携带多种不同抗性基因，可以同时处理多基因。但是转座子的应 用也有一定限制，比如要求转座子本身较短，容易操作，且对任何拟敲除区域有较 高转座效率等5 。3 RNA干扰引起的基因敲除 现在普遍认为转录后基因沉默是生物保持基因的完整性，抵御外来核酸入侵，抑 制转座因子诱导DNA突变的手段，广泛存在于真菌、植物、线虫、脊椎动物和大 肠杆菌中6 。RNA干扰（RNA interference, RNAi）是一种普遍的转录后基因 沉默的机制，由siRNA （ small intereferenceRNA）引起，siRNA是外源基因产生 的dsRNA在Dicer酶的作用下所产生的长度为21 - 22n t的一系列片段的总称，具 有很强的关闭基因的功能，能够介导RNA干涉现象,诱导出一种由siR2NA分子、核 酸酶以及螺旋酶等结合在一起的RNA诱导沉默复合物（RNA - induced sil encing comp lex, R ISC）。R ISC能够解开siRNA并精确的指导特异的mRNA降解，使细 胞抵抗外来基因侵入及病毒感染。因此，通过将dsRNA分子导入细胞内，特异性地 降解细胞内与其同源的mRNA,封闭内源性基因的表达来失活该基因同样可以实现 基因的敲除。1998年，RNAi技术首先在线虫中建立，目前已在线虫、果蝇、真菌 及拟南芥等生物中分别建立，并用于研究特定基因或已知基因在特定发育时期的 功能7 。RNAi的作用特点有：（1）特异性强，针对同源基因共有序列的RNAi 则只能导致同源基因失活，不影响其他内源性mRNA的表达；效率高,少量的 dsRNA分子就可以完全抑制相应基因的表达,能在低于反义核酸几个数量级的浓 度下研究目的基因；（3）穿透性强，RNAi抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限, 在不同细胞间长距离传递和维持8 。RNAi技术操作相对简便，结果快捷，尤 其对于那些不容易获得突变体的基因或生物体来说，RNAi技术无疑提供了一种 快速有效的研究基因功能的方法。由于dsRNA引入生物体内的剂量和时间可以人 为控制，RNAi技术可以用于研究某个特定基因在特定发育阶段的功能。伴随着 功能基因组学研究的深入，RNAi技术在研究信号传导途径、胚胎发育相关因子 以及参与基本生物反应过程的新基因功能方面有巨大发展潜力，它将带来生物学 研究的革命。虽然RNA i技术有如此明显的专一性优点，但RNA i不能作用于所有基 因和某些细胞类型（如神经元），很多设计的dsRNA不能产生抑制靶基因转录后沉 默的效果。由于RNAi实际上只是在转录后水平上降低基因的表达,并不象基因敲除那样完全把基因从基因组中剔除掉,有时也会因背景的不干净导致产生的表型 难以分析9 。因此，RNAi不能完全取代传统的基因敲除技术。基因敲除的应用 基因敲除的威力在于研究者可以选择性地修饰基因及选择如何去修饰， 最终完 全控制该段基因的DNA序列或修饰其周围的调控元件。由于几乎所有生命现象均 由基因控制或受其影响，因此打靶技术在几乎所有生物学领域如微生物学、动物 学、植物学、医学等领域都有应用价值。它目前已经广泛的应用于各个方面，并 取得了较大的进展。基因敲除在医疗领域的应用 基因敲除可用于建立人类疾病的转基因动物模型，为医学研究提供材料。从敲除 技术诞生之日直到现在,研究较多的是用小鼠ES细胞进行基因打靶，所建立的小 鼠模型多与人类遗传性疾病有关14 。已产生的模型包括与癌基因和肿瘤抑 制基因、免疫相关基因、生长因子与受体基因等。这些模型的建立为治疗人类 疾病提供了很大帮助。如1989年囊性纤维化病(CF)的致病基因(CFTR)被成功地 克隆，1992年成功建立了 CFTR基因敲除的CF小鼠模型，为CF基因治疗提供了很好 的动物模型,得以顺利通过了基因治疗的动物试验,于1993年开始临床试验并获 得成功。基因敲除用于异种器官移植。异种器官移植是将动物的器官、组织或 者是细胞导入人体体内，排斥反应是限制这一新兴技术发展的主要瓶颈。位于猪 细胞膜表面的末端a - 1, 3 -半乳糖苷转移酶抗原决定簇是引起排斥反应的 重要原因，通过a - 1, 3 -半乳糖苷转移酶的基因敲除，为家猪可成为人体器官 的有效供体提供了可能15 。除以上外，基因敲除还可用于治疗遗传病等，包 括去除多余基因或修饰改造原有异常基因以达到治疗目的。基因敲除用于改造动植物基因，鉴定新基因和其新功能，研究发育生物学 深入研究基因敲除生物的发育及生命各期的表现， 可以得到详细的有关该基因在 生长发育中的作用，为研究基因的功能和生物效应提供模式。例如，目前人类基 因组研究多由新基因序列的筛选检测入手，进而用基因敲除法在各类生物体上观 察该基因缺失引起的表型变化。目前已报道了多种学习、记忆以及LTP、LTD有 缺陷的基因敲除动物，发现多种基因在学习、记忆的形成过程中必不可少。动植物育种对动植物的基因进行修饰改造,可产生一些人类需要培育的生物新品种。敲除技 术使得人们对定点、定量地改变生物基因组结构的梦想成为现实,对动植物进行 高效而安全的遗传改良成为可能,伴随体细胞克隆技术的日益成熟,转基因动物 的研究也将会上一个新台阶。这必将为人类解决粮食等相关重大问题带来巨大 的机遇。基因敲除技术是遗传工程中的一个重大飞跃。它已经在疾病机理的研 究、医疗、植物基因功能的研究等各个方面体现出了强有力的作用,这项新技术 无论是在基础理论研究还是在实际应用中都将有着广阔的应用前景。三 总结基因敲除技术存在问题及应用前景自20 世纪80 年代建立并发展起来后,基因敲除技术已经应用到许多领域, 如疾病模型的建立和临床治疗、异种器官移植、动物育种等,成为功能基因组学 研究的重要手段。随着基因敲除技术的发展，早期技术中的许多不足和缺陷都 已经解决， 但基因敲除技术始终存在着一个难以克服的缺点， 即敲掉一个基 因并不一定就能获知该基因的功能，其原因包括：一方面，许多基因在功能上 是冗余的，敲掉一个在功能上冗余的基因，并不能造成容易识别的表型， 因为 基因家族的其他成员可以提供同样的功能