沙门氏菌全基因组测序为基础的研究工作沙门氏菌为一群寄生于人和动物肠道内的无芽抱、革兰氏阴性直杆菌，可引起人和动物 肠热症、胃肠炎、败血症等，呈全球性分布。沙门氏菌病是指由各种类型沙门氏菌所引起 的对人类、家畜以及野生禽兽不同形式的总称。感染沙门氏菌的人或带菌者的粪便污染食品， 可使人发生食物中毒。据统计在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中 毒常列榜首。我国内陆地区也以沙门氏菌为首位。沙门氏菌病的病原体。属肠杆菌科，革兰 氏阴性肠道杆菌。已发现的近一千种(或菌株)。沙门氏菌为临床常见的肠道致病菌， 毒性最强的有可能引起败血症、脑膜炎等致命感染。它每年在全球约造成1600 万感染病例，其中60万例死亡。因而完成对沙门氏菌菌株基因组序列的解析， 为基础和临床研究提供了重要的生物信息数据，有助于新药的开发，在病症的预 防、诊断和治疗上将发挥更好的作用。1. 构建疫苗载体随着人们对沙门氏菌基因表达调控、侵入机制、毒力基因的深入研究以及DNA重组技 术的不断发展，尤其是沙门氏菌全基因组测序的完成，使得在细菌基因组水平上对其进行基 因缺失减毒成为可能。减毒后的沙门氏菌仍保持了其侵入巨噬细胞、树突细胞的能力，因此 可作为疫苗载体将其携带的抗原蛋白或DNA疫苗靶向性的传递给抗原递呈细胞从而更为有 效地激发免疫应答。减毒沙门氏菌作为疫苗载体具有运送效率高，免疫方法简单，免疫效果 较好，能同时激发全身免疫和局部粘膜免疫等优点，有着良好的应用前景。目前，减毒沙门 氏菌已作为疫苗载体在针对细菌、病毒、寄生虫等的疫苗得以广泛研究并取得了很大进展。 沙门氏菌的基因缺失减毒沙门氏菌具有致病性，而作为疫苗载体必须具备良好的安全性，因 此对沙门氏菌的有效减毒是将其作为疫苗载体的先决条件。目前许多与沙门氏菌在宿主体内 存活相关的基因被鉴定出来，并被缺失。这些缺失的基因可分为两类，一类是与细菌营养代 谢相关的基因；一类是沙门氏菌抵抗力、毒力相关的基因。这些基因会对沙门氏菌的应用产 生很大影响。减毒沙门氏菌载体因其具有特殊的优点而成为疫苗研究的热点，已被广泛应用于病毒、 细菌、寄生虫等疫苗的研制并展示了良好的应用前景。但其仍然存在一些问题，如携带的高 拷贝质粒导致体内细菌携带质粒的迅速丢失、针对沙门氏菌载体的免疫应答将消弱其传递的 DNA疫苗免疫效果、诱导的体液免疫反应不足等。目前，以减毒沙门氏菌为载体的疫苗虽 然只能作为常规疫苗的一种补充，但随着生物学技术的发展，尤其是基因工程改造技术的不 断完善和发展，减毒沙门氏菌载体在疫苗研究中将体现出更大的应用价值。2, 病原检测-沙门氏菌属的PCR鉴定沙门氏菌引起的中毒病例在世界各地的食物中毒病例中所占数量比例非常高。有资料统 计，在我国70 %80 %细菌性食物中毒事件是由沙门氏菌引起，而引起沙门氏菌中毒的食 品中，约90 %是肉、蛋、奶等畜产品。目前，在进行食品质量安全监控的中国计量认证(China metrology accreditation,CMA)检测时，沙门氏菌的检测已成为必检的卫生指标之一。传统的 检测方法是先采用非选择性和选择性增菌，然后分离培养、生化反应和血清学鉴定，检验程 序十分繁琐，且肠杆菌科细菌间的生化反应多有交叉，需4 d7 d才能完成，因此传统的 检测方法在快速、敏感与特异性等方面有自身的局限性。随着分子生物学及分子细菌学的发展，普通PCR以其迅速、简便和灵敏等优点成为科 研和临床诊断的技术热点，已广泛用于食品中以及临床样品和环境中的沙门氏菌的检测。但 是，传统PCR技术在临床应用中遇到了一些棘手的难题：PCR产物的污染、PCR后处理 步骤繁杂冗长以及不能准确定量等，这些问题妨碍了 PCR技术在临床上的应用。荧光定量 PCR技术的应用为病原的检测提供了一种新的手段，该技术不仅实现了对DNA模板的定 量，而且具有敏感性高、特异性强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、实时性和 准确性等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。针对编码沙门氏菌肠毒素stn基因设计引物和探针，经过优化各个反应条件和体系， 建立了检测食品中沙门氏菌的荧光定量PCR方法，为沙门氏菌的检测提供了更快速、敏感 的方法。荧光定量PCR是近年来发展起来的一项新技术。它不仅实现了对DNA的定量检 测，而且具有较高的敏感性、特异性、可靠性和时效性，且自动化程度高、无污染性，能够 同时完成多样品的扩增及定量，适宜于大批样品的检测。荧光定量PCR技术的这些特点使 得它在食品中进行病原检测和疫病监测具有其他检测方法无可比拟的优越性。用荧光定量PCR方法检测样品中的细菌，模板DNA的制备非常关键，制备的模板 DNA质量直接影响到检测结果的准确性。要获得可靠的检测结果，很大程度上取决于模板 DNA的纯度和核酸的数量。目前大多数的PCR检测方法仍采用离心、过滤、阴阳离子交 换树脂、固定化凝集素和免疫磁性分离等方法对食品体系中的细菌进行富集。本研究通过对 各种方法进行比较，采用热裂解法制备模板DNA。在模板DNA制备时采取了前增菌步骤, 这样使得模板DNA量大大增加，并消除了食品中存在的抑制因素，尽管没有经过DNA的 纯化等步骤，但获得的DNA模板量能使PCR得以检出。热裂解法制备模板DNA的方法 具有操作简单，且不需接触酚等有毒化学试剂等优点。影响荧光定量PCR敏感性的因素较多，如反应体系中Mg2+、引物、探针的浓度及 PCR扩增循环数等。Mg2+是影响Taq酶活性的关键因素，如果Mg2+的浓度无法使Taq 酶发挥最佳活性，必然会影响到实时定量的敏感性。一般来说，应选择2 mmol/L5 mmol/L 浓度的MgCl2。引物和探针的浓度也会影响反应的特异性，较高的引物浓度会导致非特异 性产物扩增。引物浓度一般在0.1日mol/L0.6 g mol/L、探针浓度在0.05日mol/L 0.3日 mol/L之间较为合适。3.沙门氏菌耐药性和疫苗等药物研发沙门氏菌为临床常见的肠道致病菌，血清型多达2400种，其致病机理复杂，感染者轻 则造成腹泻，引发败血症，重则危及性命。而沙门氏菌疫苗等相关药物研究却不充分，沙门 氏菌全基因组测序后，将加快这一方面的研究。生素抗耐药性是在Typhimurium的一个日益增长的问题，理想地，我们希望这项工作将 识别可能的新药物靶，减少更多具有抗性细菌的威胁。研究者在Typhimurium基因组中识 别了 4595个推测的基因，许多是以前未知的，包括156种可能的膜蛋白，可以作为潜在的 药物或者疫苗的作用靶。他们也发现两种先前未知的基因簇，能够产生包被细菌的纤毛或菌 毛。这些纤毛使细菌依附在肠道里。这也可以作为药物靶防止细菌在肠道中被吸附，预先排 除了传染的可能。研究者也把Typhimurium的基因组与几种密切相关的细菌相比较。结果 显示，Typhimurium包含许多在沙门氏菌属中的感染冷血动物的亚种中丢失的未知的基因。 “那些基因能使Typhimurium传染温血动物宿主，这个研究小组与正在与进行引起人类伤寒 的沙门氏菌测序工作的小组密切合作。两个基因组的比较显示造成伤寒的沙门氏菌有超过 200个假基因，它们在有机体内从未用过或已经丧失能力。Typhimurium仅有39个假性基 因。他们进一步将分析假性基因引起的功能损失。这些仅仅是能从基因组序列收集的信息 的一些例子，现在，微生物学者可以得到这些数据，进一步证明每一个我们推测的基因是否真正有其生物学意义。美国已成功地完成了缺失双基因的鼠伤寒沙门氏菌活疫苗的研制，并进行了靶目标和动 物效能定。这种微生物缺少cya和crp基因，无感染性，繁殖速度比常规鼠伤寒沙门氏菌 慢，没有荚膜性和毛。从形态学和生长特征上可以和常规鼠伤寒沙门氏菌区分。尽管这种微 生物在肠道存活时间不长，仍具抗原性，刺激产生抗一系列沙门氏菌的抗体（包括肠炎沙门 氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和海德堡沙门菌等）。这种双基因缺失突变体的安全性高于欧洲普遍 使用的单基因变异体。应用研究结果显示，刚出壳的肉雏鸡可用这种疫苗进行首次粗雾滴喷 雾免疫，14日龄再加强饮免疫一次，可保护到8周龄。后备种鸡和青年鸡首免剂量要高于 肉雏鸡，饲养中期再加强免一次。虽然这种疫苗可有效地控制沙门氏菌的繁殖，但控制沙门 氏菌需要综合的生物安全措施。消灭沙氏菌需要无沙门氏菌种鸡群，无沙门氏菌污染的种 蛋，无沙门菌感染的颗粒料，无野鸟和鼠害的鸡舍等欧洲的单基因缺失沙门氏菌突变体活疫 苗效果很好，美国的双基因缺失苗也一定会不错。由于缺两个基因，这种疫苗不可能恢复为 田间沙门氏菌，因此安全性更高。沙门氏菌菌株基因组序列解析的完成，为沙门氏菌的基础和临床研究提供了重要的生物 信息数据，并为今后的预防、诊断和治疗打下了坚实的基础。此外，该项目对于新药物的研 究和疫苗的研发也将产生积极的推动作用。