人重组白细胞介素 -8 在大肠杆菌的表达、鉴定【摘要】目的利用PCR技术扩增hlL-8 cDNA将其连接于原核表达载体 pKpL-3a（含PL启动子）中，并在大肠杆菌中表达、鉴定。方法PCR技术扩增hlL-8 cDNA获取目的基因，将该基因重组到大肠杆菌表达载体pKpL3a质粒中，重组DNA分子转化到Pop2136大肠杆菌中，利用其所产生的温度敏感性入阻遏蛋白来调控外源基因表达，经ELISA反应检测其表达水平。结果 带hlL-8基因的重组 pKpL3a质粒成功转化到Pop2136大肠杆菌中，经诱导，表达了 IL-8并经ELISA反 应检测了其表达水平。结论：hlL-8成功在大肠杆菌中表达。【关键词】hlL-8 PCR重组基因 表达正文趋化因子（Chemokin是一组具有趋化作用的细胞因子，能吸引免疫细胞 到免疫应答局部，参与免疫调节和免疫病理反应。白细胞介素 -8（lnterleukin-8） 属于趋化因子家族成员，其分子中含有 Cys-X-Cys的三联氨基酸序列，因而属于 CXC趋化因子亚家族（a家族）0 IL-8的重要生物学功能是对中性粒细胞、嗜碱性 粒细胞和T细胞具有区划作用，并可促进中性粒细胞的活化，在炎症反应中是一 种重要的炎症因子。另外，IL-8还具有促进造血细胞增殖及新生血管生成作用， 在伤口愈合和肿瘤生长及转移的过程中发挥重要作用0由于天然来源的IL-8含量极低，难以大批量制备，因而只能利用基因工程技 术进行表达和生产0 其基本过程是： 获取目的基因； 表达载体的选择和构建； 目 的基因与表达载体的拼接；重组 DNA分子转化到大肠杆菌；使其复制转录并合 成重组的免疫分子。利用重组技术，可使大肠杆菌成为生产IL-8的生物工厂。这 种生物工厂一旦建造成功 , 只要供给大肠杆菌适当的生长条件 , 就可提供取之不 尽的 IL-80 1 材料与方法1.1 主要材料1.1.1 菌株与载体Pop2136大肠杆菌和含pKpL-3a质粒的大肠杆菌由本实验室提供。1.1.2 工具酶与试剂TaqDNA聚合酶及其buffer购于北联生物医学工程公司。dNTPmix购于Takara 公司。Klenow酶购于北联生物医学工程公司。内切酶 Styl、Xba!购于Takara公 司。T4 DNA连接酶及其buffer购于Takara公司。1.1.3 PCR引物的设计、合成上游 5 弓丨物：agt gct aaa gaa ctt aga tgt下游 3 旬物：ccg tct aga tta tga att ata agc cct ct内含 Xba!酶切位点和 TAA终 止密码）由Takara公司合成。1.1.4 主要仪器PCR仪，微量加样器（20卩、200卩、1000）1,高速台式离心机，DYY-10型 电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统，水浴摇床，孵箱，酶标仪，一次性酶标板等。1.2 试验方法1.2.1 PCR技术扩增 hlL-8cDNA在Eppendof管中依次加入下列成份构建总体积为50卩的反应体系：ddH2O37卩、10X buffer 51、QNTPmix 5 上游引物1 、下游引物1卩、cDNA模板1卩、 Taq酶1卩。调节PCR仪，设置95。（预变5分钟。9430秒，6000秒，720分 钟，反应30个循环。最后721再延伸5分钟。在设定好的PCR仪上进行反应。 反应结束后取出10卩进行琼脂糖凝胶电泳。向管中余下的 40卩反应体系中加入 Klenow酶1门 室温30分钟，以修平扩增片段的3象端。之后转至1.5ml离心 管中，加入50卩酚-氯仿-异戊醇并混匀，10000rpm，30秒离心。吸取上层清液 转至另一已加入5山3M NaAc的1.5ml离心管中，加入150卩无水乙醇，-20。（放 置 1 小时。 10000rpm， 10分钟离心，弃上清，加入 0.5ml 70%乙醇， 10000rpm， 5分钟离心，弃上清，空气中干燥，溶于20卩l TE1.2.2 DNA琼脂糖凝胶电泳配置 0.8%琼脂糖凝胶板。充分凝固后从制胶槽中卸下凝胶板，放入电泳槽， 加入TA（ X 1，使其液面略高于琼脂糖板，拔出样品梳。DNA样品10卩加5卩IGEBS 样本液，在蜡面纸上混匀，全部加样于琼脂糖的样品孔中。 稳压电泳80v约2小 时，是溴酚蓝指示剂泳动到适当位置，1-5v/cm。取出凝胶板置溴化乙锭中染色 20 分钟。在凝胶成像仪观察结果。1.2.3 质粒提取从转化平皿上接种一单菌落到LA培液体养基中，37 C震荡培养，待细菌浓度 增至OD600=1.5时，收获细菌。取菌液 1ml转至Eppendof管中，8000rpm，2 分钟离心，弃上清。加入200卩缓冲液A,充分混匀。力卩200卩碱溶液裂解细菌， 反复倒转管5次至溶液清亮，开盖后能拉出丝状粘稠液体。加200卩乙酸缓冲液， 反复倒转管 5次混匀，冰浴 10分钟（宁短勿长）。 10000rpm 5分钟离心，上清 转至另一 Eppendof管中，力卩2.5倍体积的无水乙醇，混匀，-20C放置1小时。 10000rpm 5分钟离心，弃上清，加入 70%乙醇 0.5ml。 10000rpm 5分钟离心，弃 上清，干燥。加入50卩l TE使质粒溶解，酶切备用。1.2.4 限制性内切酶消化取两个Eppendof管分别标记A、B，依次加入下列物质构建两个反应体系。A 管: ddH2O 16 卩 I、10X H buffer 2、质粒 DNA 1卩、Sty 11 ZB 管: ddH2O 14 卩 I、 10X M buffer 2、0.1%BSA2y、PCR产物 1 卩、XbaI1 卩。37C水浴 45 分钟。A管中加入1卩lKlenow酶、2卩ldNTPmix室温30分钟，加50卩酚-氯仿-异 戊醇，混匀，10000rpm 5分钟离心，取上层液转至另一 Eppendof管中，加100卩, 无水乙醇、4卩乙酸钠，混匀，-20C沉底1小时。10000rpm 10分钟离心，弃上清， 100 卩 l 70乙醇洗涤一次，干燥。加入 2 卩 l 10 X M buffer l 0.1%BSA 1 卩 l XbK,370水浴45分钟。加50卩酚-氯仿-异戊醇，混匀，10000rpm 5分钟离心，取上层 液转至另一 Eppendof管中，力卩100卩无水乙醇、4卩乙酸钠，混匀，-20t沉底1 小时。10000rpm 10分钟离心，弃上清，100卩I 70临醇洗涤一次，干燥。加 20卩I TE进一步用于连接反应。B管中加50卩酚-氯仿-异戊醇，混匀，10000rpm 5分钟离心，取上层液转至 另一 Eppendof管中，力卩100卩无水乙醇、4卩乙酸钠，混匀，-20。（沉底1小时。 10000rpm 10分钟离心，弃上清，100卩I 70?乙醇洗涤一次，干燥。加 20卩TE进 一步用于连接反应。1.2.5 DNA 连接在Eppendof管中加入下列物质构建反应体系进行连接反应：H20 9.5卩、110X T4 DN连接酶 buffer 2.5、jpKpL3a质粒 DNA 7卩、1 IL-8 PCR产物 5 卩、1 T4 DNA 连接酶1 。置12-160水浴反应过夜。650水浴15分钟，灭活T4 DNA连接酶， 用于转化。1.2.6 转化将无质粒大肠杆菌 pop2136 接种于 1mI LB 培养基 370培养 3-5 小时。待 OD600=0.4时转移至 Eppendof管中，8000rpm 2分钟离心，弃上清。加 200卩l 100mM Cacl2混匀，冰浴30分钟。加10卩连接好的质粒DNA,混匀，冰浴30 分钟，370水浴2分钟，冰浴2分钟。加入1ml LB培养基，370培养0.5小时。取 出50卩涂于LA培养皿上（含氨苄青霉素），37 0到置培养过夜，检查转化菌是否 生成（只有转化的细菌才能在平皿上生长 ）。1.2.7细胞因子的测定一ELISA双抗体夹心法包被：将稀释好的包被抗体加入 ELISA板，100卩1/孔，放置湿盒中，4024小 时。洗涤：加入洗涤液洗涤 1 分钟/次，共 3次。加样：加入待测样品、阴性对 照及倍比稀释的标准品，100卩孔，放置湿盒中，37030分钟。洗涤：同前。力卩 酶标抗体：100卩l孔, 100卩I孔，放置湿盒中，370 30分钟。洗涤：同前。加显 色剂：A液（TMB,四甲基联苯胺）1滴，B液（H2O2） 1滴，室温显色5-10分 钟。终止反应：加中止液（2mol/L H2SO4。测OD值：酶标仪测450nm处OD 值，以OD值为横坐标，标准品浓度为纵坐标绘制标准曲线。2 结果2.1 DNA琼脂糖凝胶电泳见图1。检查扩增结果，9组都见一致的扩增区带，PCR产物与设计的228bp相符， 并无非特异性扩增，说明目的基因扩增成功。123456789图1 DNA琼脂糖凝胶电泳分析注：PCR Products:228bp2.2 ELISA双抗体夹心法检测IL-8含量所测0D值和标准曲线见表1和图2表1 450nm处OD值4组Measureme ntcount:1Filter: 450123456789101112AB0.810.4850.9141.6540.4450.6141.70.2411.5030.155C0.7350.6330.9391.7020.4490.3641.4150.3831.4120.754D0.8360.6180.9211.2370.3660.3841.3390.3521.4810.261E0.8610.7471.1691.840.3580.5750.3430.5420.2260.11F0.3211.1981.512.1360.7040.8820.7041.1080.550.192G0.3771.5652.1981.8760.4480.6540.6120.9490.9150.408H图表标题请度ng/ml图2 ELISA双抗体夹心法标准品0D值标准曲线根据标准品的浓度和试验所测0D值，计算出待测样本的 hlL-18浓度为10.4 ng/ml。3讨论本实验首先通过PCR技术扩增hlL-18cDNA反应结束后取出少量做琼脂糖凝 胶电泳，根据图1的结果可以看出，引物的设计和PCR反应条件的设计是很成功 的。而在PCR反应中，引物的设计尤为重要。引物设计有3条基本原则：首先引 物与模板的序列要紧密互补；其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹 结构；再次引物不能在模板的非目的位点引发ZML聚合反应(即错配)。具体实现这3条基本原则需要考虑到诸多因素。 引物的长度一般为1530bp,常用的是 1827bp,但不应大于 27bp，因为过长会导致其延伸温度大于74C，不适于TaqDNA聚合酶进行反应；引物序列在模板内应当没有较高相似性片段，尤其 是3端相似性较高的序列，否则容易导致错配 ；末位碱基为A的错配效率明 显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3端使用碱基A；引物序列的GC 含量一般为40%60%过高或过低都不利于