人同型半胱氨酸(Hcy)酶联免疫分析试剂盒使用说明书厦门慧嘉生物科技有限公司本试剂盒仅供研究使用检测范围： 0.8 nmol/ml -50 nmol/ml最低检测限：0.2 nmol/ml特异性：本试剂盒可同时检测天然或重组的人Hcy，且与其他相关蛋白无交 叉反应。有效期：6个月预期应用：ELISA法定量测定人血清、血浆、细胞培养上清或其它相关生 物液体中Hcy含量。说明1. 试剂盒保存：-20C(较长时间不用时)；2-8C(频繁使用时)。2. 浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。3. 中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。4. 刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实 验结果造成任何影响。概述同型半胱氨酸Hcy又称高半胱氨酸，是一种含硫氨基酸，不属于组成蛋 白质的20种氨基酸，体内不能合成，只能来源于蛋氨酸的分解代谢。Hcy是 甲硫氨酸代谢形成的中间产物。，在体内由甲硫氨酸转甲基后生成，有两种途 径。再甲基化途径：约有50%Hcy在蛋氨酸合成酶的作用下，以维生素B12 为辅因子，以N5-甲基四氢叶酸为甲基供体，发生再甲基化，重新合成蛋氨酸。 转硫途径：另外约50%的Hcy经转硫途径不可逆生成半胱氨酸和a酮丁酸， 此过程需维生素B6依赖的胱硫醚P合成酶和甲硫氨酸合成酶参与。Hcy合成 和代谢途径及其相关的酶系统、叶酸、维生素B12和维生素B6的缺乏、 MTHFR、甲硫氨酸合成酶(MS)、CBS的缺陷都可引起高同型半胱氨酸血症。实验原理用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗Hcy抗体的微孔中 依次加入标本或标准品、生物素化的抗Hcy抗体、HRP标记的亲和素，经过 彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并 在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的Hcy呈正相关。用 酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，计算样品浓度。试剂盒组成及试剂配制1. 酶联板(Assay plate ):一块(96 孑L)。2. 标准品(Standard)：2瓶(冻十品)。3. 样品稀释液(Sample Diluent):1x20ml/ 瓶。4. 生物素标记抗体稀释液(Biotin-antibody Diluent):1x10ml/瓶。5. 辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液(HRP-avidin Diluent)：1x10ml/瓶。6. 生物素标记抗体(Biotin-antibody):1x120ul/ 瓶(1： 100)。7. 辣根过氧化物酶标记亲和素(HRP-avidin)：1x120ul/瓶(1： 100)。8. 底物溶液(TMB Substrate):1x10ml/瓶。9. 浓洗涤液(Wash Buffer)：1x20ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。10. 终止液(Stop Solution)：1x10ml/瓶(2N H2SO4)。需要而未提供的试剂和器材1. 标准规格酶标仪2. 高速离心机3. 电热恒温培养箱4. 干净的试管和Eppendof管5. 系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，最好用多通道移液器6. 蒸馏水，容量瓶等标本的采集及保存1. 血清:全血标本请于室温放置2小时或4C过夜后于1000 x g离心20分钟， 取上清即可检测，或将标本放于-20C或-80C保存，但应避免反复冻融。2. 血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2 - 8 C 1000 x g离心15分钟，或将标本放于-20C或-80C保存，但应避免反复冻 融。3. 细胞培养物上清或其它生物标本：请1000 x g离心20分钟，取上清即可 检测，或将标本放于-20C或-80C保存，但应避免反复冻融。注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。标本的稀释原则：首先通过文献检索的方式了解待测样本的大致含量，确定适当的稀释倍数。 只有稀释至标准曲线的范围内，检测的结果才是准确的。稀释的过程中，应 做好详细的记录。最后计算浓度时，稀释了”倍，标本的浓度应再乘以“N”。 标准品的稀释原则：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后 静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为50 nmol/ml，做系 列倍比稀释后，分别稀释 50 nmol/ml，25 nmol/ml，12.5 nmol/ml，6.2 nmol/ml， 3.2 nmol/ml， 1.6 nmol/ml， 0.8 nmol/ml.，样品稀释液直接作为标准浓度 0 nmol/ml，临用前15分钟内配制。如配制25 nmol/ml l标准品：取0.5ml（不要少于0.5ml）50 nmol/ml的上述标 准品加入含0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类 推。生物素标记抗体的稀释原则：临用前以生物素标记抗体稀释液稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所 需的总量配制（每孔100ul），实际配制时应多配制0.1-0.2mlo 如 10ul生物素 标记抗体加990ul生物素标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一 小时内配制。辣根过氧化物酶标记亲和素的稀释原则：临用前以辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液稀释，稀释前根据预先计算好的 每次实验所需的总量配制（每孔100ul），实际配制时应多配制0.1-0.2mlo 如 10ul辣根过氧化物酶标记亲和素加990ul辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液 的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。操作步骤实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀 时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时，用样品 稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。1. 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100ul, 余孔分别加标准品或待测样品100ul，注意不要有气泡，加样将样品加于 酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜， 37 或应120分钟。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。2. 弃去液体，甩十，不用洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液100ul （取1ul 生物素标记抗体加99ul生物素标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀， 在使用前一小时内配制），37C,60分钟。3. 温育60分钟后，弃去孔内液体，甩十，洗板3次，每次浸泡1-2分钟， 200ul/每孔，甩十。4. 每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液（同生物素标记抗体工作液） 100ul，37C，60 分钟。5. 温育60分钟后，弃去孔内液体，甩十，洗板5次，每次浸泡1-2分钟， 200ul/每孔，甩十。6. 依序每孔加底物溶液90ul，37C光显色（30分钟内，此时肉眼可见标 准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。7. 依序每孔加终止溶液50ul，终止反应（此时蓝色立转黄色）。终止液的加 入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底 物反应时间到后应尽快加入终止液。8. 用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。在加终止液后 15分钟以内进行检测。实验备注1. 用户在初次使用试剂盒时，应将各种试剂管离心数分钟，以便试剂集中到 管底。2. 每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是最后加底物溶 液及2N H2SO4。测量时先用此孔调OD值至零。3. 为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上 盖或覆膜。4. 未使用完的酶标板或者试剂，请于2-8C保存。标准品、生物素标记抗体 工作液、辣根过氧化物酶标记亲和素工作液请依据所需的量配置使用。请 勿重复使用已稀释过的标准品、生物素标记抗体工作液或、辣根过氧化物 酶标记亲和素工作液。5. 建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性。洗板方法手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上 铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml 注入孔内，浸泡1-2分钟。根据需要，重复此过程数次。自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。计算以标准物的浓度为横坐标（对数坐标），OD值为纵坐标（普通坐标），在半对 数坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度； 再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方 程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即 为样品的实际浓度。注意事项1. 当混合蛋白溶液时应尽量轻缓，避免起泡。2. 洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。3. 一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。4. 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。5. 如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请最后乘以稀释 倍数。6. 在配制标准品、检测溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，不能混淆。7. 底物请避光保存。8. 不要用其它生产厂家的试剂替换试剂盒中的试剂。