动物遗传学读书报告之新基因的分离克隆及功能鉴定学院班级：动物科技学院动物科学10级 2班新基因分离克隆及功能鉴定方法研究进展前言随着 DNA 分子双螺旋结构、密码子等的被发现，几种模式生物基因组测序和人类基因组计划的相继完成，使人们对基因的研究很快进入后基因组时代。基因组学时代的主要任务是图谱制作性和序列测定，后基因组学时代则是进行基因组功能注释，这也是功能基因组学的主要研究目标。而 PCR 技术的诞生，推动了许多新技术和方法的应用。1. 基因的分离克隆基因克隆是指通过分子生物学手段进行基因分离，从而进一步研究其结构功能。分子克隆是指在体外对不同生物的DNA 分子进行人工剪切，重新组合得到新的遗传物质通过载体转入到宿主菌或细胞中表达，扩增带目的基因的重组DNA 。基因克隆的目的是分离基因，分子克隆是分离基因的最终手段。1.1 基因的分离克隆主要方法基因分离与克隆是基因工程的第一步，它是利用分子克隆技术获取用于转化、控制目的性状相关的基因。一般方法是先建立文库(基因组文库或 cDNA 文库 ，再利用适当的探针，通过分子杂交从基因文库分离出目的基因，这是应用最早，目前最为成熟的一种方法。而对于未知序列，常采用步移的方法，其原理是如果知道离开该基因一定距离上的DNA 序列，则可用这个DNA 序列作探针，通过染色体步移来逐步接近并最后达到待克隆的基因。先用探针筛查文库，得到阳性克隆后，将这个重组载体中的插入片段分离出来，然后用这个片段的末端部分 (注意不能包含重复序列 作为新一轮筛查文库的探针；得到新的重组载体中的插入片段，同上一个插入片段的末端部分 (即探针序列 是重叠的，共有的。也就是这两个片段是在同一条染色体上相互邻接的。于是，再用新得的插入片段的末端部分作为探针，再去筛查文库。通过一系列的操作，得到的插入片段逐渐连接延伸，最后可以步移到待克隆的基因。 以下对目的基因分离和克隆方法作一总结。1.1.1 功能性克隆通过基因产物的克隆技术在传统遗传学占主导地位的时代，人们以基因产物为导向来分离克隆基因。由于基因产物的结构、功能已知，可通过分析部分多肽或末端氨基酸序列，反推其核苷酸序列，设计探针或引物从基因组DNA文库或cDNA文库中筛选克隆，也可以制备产物抗体，从表达载体构建的cDNA文库中筛选相应克隆，进而分离目的基因。若可得到足够多的纯化目的蛋白以用于制备特异性抗体时，可以采用经典的免疫筛选表达文库的方法，筛选阳性克隆获取其目的基因。除了免疫筛选方法外，也可根据目的蛋白的生物学功能，利用同位素标记的配体来筛选受体表达的阳性克隆。当所分离的目的蛋白较难大量获得，但纯度较高时，可利用其中的一段氨基酸序列，反推出其基因序列，据此合成寡核苷酸用于cDNA文库的筛选；或根据所获得的基因序列，指导5端的引物合成，根据mRNA 3端poly A 序列指导合成poly T 的 3端引物，用 PCR 技术从制备细胞的mRNA或直接从胞浆内溶物中合成相应的cDNA ，将该 cDNA 克隆到表达载体上进行产物表达。1.1.2 同源性序列克隆技术随着基因研究的不断深入，人们发现几乎所有的基因与其他的基因都有一定的联系：生物的种、属之间编码基因序列的同源性高于非编码区的序列。基于此原理，在其他种属同源基因被克隆的前提下，构建cDNA 文库或基因组文库，然后用已知分子高保守序列设计简并引物，并用简并引物对含有目的基因的DNA 文库进行 PCR 扩增，再对 PCR 扩增产物进行扩增、克隆和功能鉴定。对于同源性很高的基因，可以直接用作探针进行非严谨性杂交筛选另一物种的 DNA 文库。同源性序列克隆技术自提出以来，受到国内外学者的广泛重视，发展很迅速，但有些问题值得重视和思考：由于密码子的简并性和不同同源序列间同源程度的差异，简并引物的特异性要设计得当，必要时需要设计几套引物组合。由于某些同源序列并不专属于某一基因家族，因而扩增产物不一定是某一基因家族成员。基因家族成员往往成簇存在，克隆的基因片段是否为目的基因尚需进一步判断。因此对 PCR 扩增产物和克隆产物，有必要进行基因与性状共分离分析，插入失活或遗传转化等功能鉴定工作，以便最终筛选到目的基因。1.1.3 表型克隆技术细胞在增殖、分化、外界环境变化等某些异常状态下，常有某些新基因特异性表达或表达异常地增高，而另一些基因可能表达降低或缺失，因而分离差异表达基因将是认识生物体的生长发育等生命活动过程的入手点，以此为基础，才能深入理解基因的结构、功能、表达与调控。差异表达基因的分离方法也伴随分子生物学技术的发展由单一化发展为多元化，而且呈各种方法互相结合的趋势。分离差异表达基因的 3 种基本方法为：差式筛选、扣除杂交、差异展示反转录。1.1.3.1 差式筛选法差式筛选法是分别从有特异表达基因的目标样和无特异表达基因的参照样中提取mRNA ，反转录为 cDNA ，并构建 Ts 的 cDNA 文库，分别将从 TS 和 RS 中提取 mRNA 制成 cDNA 探针，分别用 TS 和 RS 的 eDNA 探针与 TScDNA 文库的菌落或噬菌斑作原位杂交，选出只与 Ts 杂交，而不与 RS 杂交的克隆即为 TS 特异表达的克隆。此法常要经过多轮菌斑杂交，不仅费力费钱，重复性差，而且灵敏度很低。1.1.3.2 扣除杂交扣除杂交则是用 TS 提取的 mRNA 反转录成 cDNA 探针与 Rs 的过量 mRNA或 cDNA 杂交，经两轮充分杂交后，移去杂交分子和过量的RS 的 mRNA 或cDNA ，将不形成杂交体的 TS 的 eDNA 纯化富集，扩增，建立相应 cDNA 文库即为差异表达基因 cDNA 文库。但此法回收 cDNA 量有限，重复性差，灵敏度低。1.1.3.3DDRT PCRDDRT PCR 则是分别用 Ts 和 RS 的总 mRNA 作模板，利用 12 个可能的锚定引物T 11MN锚定mRNA的olyA末端，借助逆转录酶合成cDNA第一链，得mRNA cDNA，再用相同的3锚定引物和5端随机引物分别扩增TS 、RS 的mRNA cDNA ，扩增产物用序列胶电泳分析差异表达情况，将差异带DNA 回收，可进一步鉴定分析，最终获得差异表达基因。它与前二者相比，速度快，易操作，可以鉴定低丰度差异表达的 mRNA 。分析 2 种以上样品基因的差异表达等优点，但仍存在假阳性率高、重复性差、扩增片段短等问题。1.1.4 代表性差示分析法 (RDA代表性差示分析法 (RDA 可用于分离与生理条件改变相关的基因及不同发育阶段差异表达的基因，具体过程如下：制备扩增子。提取TS 和 RS 的 mRNA 并反转录制备双链 cDNA 即 test 。er eDNA 和 driver cDNA 。然后用限制性内切酶切，将酶切片段装上接头，末端补平后，加入接头引物进行PCR 扩增。扣除杂交。去除接头后仅对tester 片段加上新的接头，用过量的driver cDNA 与之杂交退火，将形成三种产物： tester tester 、 tester driver 、driver driver 。特异性片段的扩增。末端补平后，加入新接头引物进行PCR 。 3 种产物中仅自身退火形成的tester tester 两端均能和新引物配对而呈指数扩增，tester driver 仅一端可和新引物配对而呈线性扩增， Driver driver 无引物配对不扩增。然后用绿豆核酸酶去除单链 DNA 分子，再进行PCR 富集特异表达 cDNA 片段。对特异片段进行克隆，通过 FISH 等技术进一步分离特异表达基因。1.1.5 抑制性差减杂交PCR 法(SSHSSH 的基本流程如下：第1 次杂交。提取 TS 和 RS 的 mRNA 反转录为tester eDNA 和 driver eDNA ，用 Rsa I 或 Hae m酶切成平头末端cDNA ，分成均等2 份，分别加不同的接头，再分别与过量的driver cDNA 杂交，将形成 4 种产物：a ，单链 tester cDNA、b ，自身退火的 tester tester 双链、 c ，异源退火 tester driver双链、 d ，drivercDNA。第2 次杂交。合并2 份杂交产物，加入新的变性driver cDNA退火、杂交，这次除了a 、b 、c 、 d 4 种产物外还形成产物e ，e 是tester 自身退火形成，但两端带不同接头。特异性片段的扩增。末端补平后，先后加接头的内、外侧引物扩增，a 和 d 无扩增。 b 由于两端接头互补形成发夹结构也无扩增， c 仅一端有引物结合呈线性扩增，仅e 两端可配不同引物而呈指数扩增。特异性片段 e 克隆，并进一步分离差异表达基因。该法通过 2 次杂交和 2 次 PCR ，使假阳性率可降到 6，且灵敏度高。用 SSH 可一次同时分离几十至几百个差异基因，效率大增。1.1.6 交互差减差异 RNA 显示 (RSDDRSDD 的主要过程如下：交互差减。分别提取具有差异表达的2 种组织细胞A 、B 的 mRNA ，反转录为 cDNA ，并构建 cDNA 文库。将这 2 个文库进行交互差减得到 A 减 B 和 B 减 A 的 2 个差减 cDN A 文库，由于构建文库所用的噬菌体载体上带有质粒载体的结构，载体进入宿主后，其上质粒载体被切下，得质粒 cDNA 文库。差异显示。用 3锚定引物和 5随机引物对 2 个差减文库提取的 DNA 分别进行 PCR 扩增，将扩增产物用 5序列胶电泳，显示并分离差异条带，回收差异 DNA ，再次扩增后，获得富集的差异表达片段。表达分析。采用反向 Northern 分析和 Northern 分析鉴定经再次扩增的差异 DNA 片段的真伪。反向 Northern 分析是将差异显示得到的扩增后 DNA 片段转膜，分别与来自 A 、B 细胞系的总 mRNA 经反转录制备的 32 P 标记的 cDNA 第一条链探针进行杂交，只与亲本来源细胞系杂交，而不与另一细胞系杂交的即为真正差异表达的基因。对差异片段克隆、测序，并进一步分离获得差异表达的基因。RSSD 可以有效快速地鉴定由于细胞生理变化而在基因组中差异表达的基因，