紫菀的毒性部位及对小鼠的急性肝损伤作用研究 王蕾，张勉，金晶，黄芳，张朝凤摘要 目标分离富集紫菀的毒性成份，研究毒性部位的肝脏急性毒性。方法采取柱层析色谱法分离，以小鼠急性毒性为指标，筛选出紫菀的毒性部位，并测定了LD50。小鼠急性肝脏毒性研究方法关键采取的是血清生化指标(ALT，AST，TBIL)检测和肝组织病理切片检验。结果经硅胶柱层析分离富集，得到紫菀的毒性部位Fr2，其LD50为0.052 g/kg。和对照组比较，单次给药后，LD0剂量组小鼠血清ALT、AST都有显著升高，TBIL没有显著差异。组织病理学检验结果表明，紫菀毒性部位LD0剂量可引发小鼠肝脏轻度细胞水肿，可见肝细胞点状坏死、肝小叶及汇管区见有炎细胞浸润;LD100剂量下可引发小鼠肝细胞呈不一样程度脂肪变性、细胞水肿，可见肝细胞坏死、肝小叶及汇管区均见有炎细胞浸润。结论紫菀毒性部位的LD50为0.052 g/kg，单次给药小剂量对小鼠肝脏有轻微损伤，大剂量可引发小鼠较为严重的急性肝损伤并致死。关键词 紫菀;毒性部位;LD50;急性肝损伤Abstract：ObjectiveThe ethyl acetate (EtOAc) part of 90% ethanol extract of Radix Asteris (RA) showed strong toxic effect (LD50 0.19 g/kg) to mice in our previous investigation. This paper aimed to obtain a refined toxic part from the EtOAc part, and to investigate the acute hepatotoxicity of this toxic part to mice.MethodsThe toxic part was searched by comparing the toxicity of the combined fractions through the gel silica column chromatography using the death of mice as index. LD50 of the toxic part was determined. The acute hepatotoxicity of the toxic part to mice was measured by biochemical indicators (ALT, AST and TBIL) in serum and histological examination of liver.ResultsFr2 fraction obtained from the EtOAc part was confirmed as the toxic part and its LD50 was 0.052 g / kg. The acute hepatotoxic test of the toxic part in a lower dose (LD0) showed that ALT, AST were significantly increased but TBIL had no obvious changes as compared to control group. Histological examination showed that a lower dose (LD0) of Fr2 could induce slight edema and spotty necrosis of liver cell, as well as phlogocyte infiltration; and a higher dose (LD100) could induce serious liver injury in mice.ConclusionThe value of LD50 (0.052g/kg) indicate that Fr2 is the refined toxic fraction of RA. The results of biochemical indicator test and histological examination confirmed the acute hepatotoxicity of Fr2 which induced more serious liver injury to mice given a higher dose than given a lower dose.Key words：Radix Asteris;Toxic part;LD50;Acute liver injury紫菀(Radix Asteris)为菊科植物紫菀Aster tataricus L. f.的干燥根及根茎，辛、苦、温，含有润肺下气、消痰止咳的功效，用于痰多喘咳，新久咳嗽，劳嗽咳血1。历代本草及当代中医药专著均沿袭了其无毒的说法。本课题组前期研究中发觉，紫菀水煎液灌胃给小鼠有一定的急性毒性和肝脏毒性2;深入的研究表明，紫菀以90%乙醇提取毒性最强，经过毒性部位的追踪，发觉其醋酸乙酯部位为紫菀的粗毒性部位(LD50为0.19 g/kg) 3。本试验在前期工作的基础上，仍以小鼠急毒为筛选指标，对醋酸乙酯部位深入细分，得到毒性成份更集中的部位，并首次研究其对小鼠的肝脏毒性。1材料和仪器1.1动物昆明种小鼠，雄性，体质量1822 g，由南京青龙山试验动物中心提供。1.2药品及试剂紫菀购自河北省安国市药材市场，经药科大学生药学研究室张勉教授判定，凭证标本保留于药科大学生药学研究室。提取溶剂为市售90%工业酒精;石油醚、醋酸乙酯、甲醇、氯仿均为市售分析纯;薄层色谱硅胶及柱色谱硅胶为青岛海洋化工厂生产。谷丙转氨酶测定试剂盒(ALT)，批号：20211112，谷草转氨酶测定试剂盒(AST)，批号：20211112，血清总胆红素测定试剂盒(TBIL)，批号：20211112，均为南京建成生物工程研究所产品。1.3仪器旋转蒸发仪，瑞士Buchi试验仪器企业产品，型号：R2021;数显恒温水浴锅，国华电器有限企业产品，型号：HH4;电子天平，型号：PL303，Matter Toledo Group;医用数控超声仪，型号：KQ 250DE，昆山超声仪器有限企业产品。高速冷冻离心机，型号：TLG16，湘仪集团;1500酶标仪，Thermo Electrom 企业产品。2方法2.1紫菀各部位的制备方法紫菀药材粉碎成粗粉，分别用10，8，8倍量90%乙醇回流提取3次，每次1 h，合并提取液，减压回收乙醇至无醇味的稠膏状，加水混悬，依次用石油醚和醋酸乙酯萃取，得到紫菀醋酸乙酯部位。取醋酸乙酯部位浸膏，采取硅胶柱层析，氯仿甲醇梯度洗脱，各流分依据薄层色谱结果合并，得到A1、A2、A3三个部分，各部分均以1 g/kg(浸膏量)给药，给药体积0.2 ml/10g，进行急性毒性试验。取A2部位浸膏，采取硅胶柱层析，氯仿甲醇梯度洗脱，搜集各极性段的流分依据薄层色谱结果合并，得到Fr1、Fr2、Fr3三个部分。各部分均以0.4 g/kg(浸膏量)给药，给药体积0.2 ml/10g，进行急性毒性试验。2.2急性毒性试验方法健康昆明种雄性小鼠，随机分组，每组10只。试验前禁食12 h，不禁水，灌胃给对应的药品，一次给药;空白组给以相同体积的0.5% CMCNa。给药0.5 h后开始观察小鼠的中毒体征。连续7 d观察小鼠死亡情况，随时取出死亡小鼠，统计死亡时间。2.3紫菀毒性部位小鼠LD50测定试验由预试验测得紫菀毒性部位的LD0和LD100分别为0.023 g/kg和0.10 g/kg，由此确定组间剂量比值为0.75，即Fr2部位0.023，0.030，0.040，0.053，0.071，0.10 g/kg共6组(分别编为1，2，3，4，5，6组)。2.4紫菀毒性部位急性肝损伤试验健康昆明种雄性小鼠，随机分组，每组10只。灌胃给LD0剂量的紫菀毒性部位，给药体积0.2 ml/10g，空白组给相同体积的0.5% CMCNa溶液。给药后禁食12 h，不禁水，摘眼球取血，3 500 r/min离心10 min，取血清备用，解剖取肝脏，10%福尔马林溶液固定，HE染色，进行组织病理学检验。根据试剂盒说明书操作测定血清中谷丙转换酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和总胆红素(TBIL)的含量。试验数据采取t检验，P0.05表示差异有统计学意义。健康昆明种雄性小鼠，随机分组，每组10只。灌胃给予LD100剂量的紫菀毒性部位，给药体积0.2 ml/10 g，空白组给予相同体积的0.5% CMCNa溶液。给药组待小鼠死亡后解剖取肝脏，10%福尔马林溶液固定，HE染色，进行组织病理学检查。组织病理学检查判断标准：根据病变程度，记为“+”“+”“+”。表示无明显病变;“+”表示肝小叶内肝细胞水肿或肝细胞脂肪变性的细胞约占25%，肝细胞点状坏死，肝小叶内或汇管区少量的炎细胞浸润及肝细胞增生;“+”表示肝小叶内肝细胞水肿或肝细胞脂肪变性的细胞约占50%，细胞碎片状坏死，小叶内或汇管区中等量的炎细胞浸润;“+”表示肝小叶内肝细胞水肿或肝细胞脂肪变性的细胞数约占75%或以上，桥接状坏死或大片坏死，肝小叶内或汇管区大量的炎细胞浸润或淋巴滤泡形成。3结果3.1紫菀毒性部位的筛选小鼠经灌胃给药后，A2组小鼠活动显著降低，精神萎靡，被毛蓬松潮湿，双目紧闭，尾巴、爪子展现乌青色，不自主颤动等现象，呼吸先快后慢，直至呼吸停止。给药后36 h为死亡高峰期，死亡现象均发生在24 h内。尸体解剖后，肉眼观察肝显黄色或白色斑点，表现为显著的肝中毒;其它组小鼠反应正常。急毒试验结果(表1)显示，A2组小鼠给药后全部死亡，其它组未出现死亡，确定A2有毒性。A2细分的3组灌胃给药后，Fr2组小鼠体征表现同A2组，急毒试验结果(表2)显示，Fr2给药小鼠全部死亡，其它组未出现死亡，故确定Fr2部位为紫菀的毒性部位。表1A1、A2、A3给药小鼠急性毒性试验结果3.2紫菀毒性部位小鼠LD50的测定试验紫菀毒性部位不一样剂量灌胃给药后，小鼠死亡分布情况见表3，经计算得紫菀毒性部位LD50=0.052 g/kg，95%可信限为0.0390.069 g/kg。3.3紫菀毒性部位对小鼠血清生化指标的影响LD0剂量给药后，小鼠血清生化指标检测结果(表4)显示，和对照组相比，毒性部位Fr2组小鼠血清中ALT、AST值升高，TBIL没有显著性差异。表2Fr1、Fr2、Fr3给药小鼠急性毒性试验结果表3紫菀毒性部位不一样剂量给药后小鼠死亡分布情况表4LD0剂量紫菀毒性部位对小鼠血清生化指标的影响3.4紫菀毒性部位对小鼠肝脏组织形态影响LD0剂量单次给药，小鼠处死后解剖，肉眼观察肝脏呈鲜红色，质柔软，和空白组无显著差异;LD100剂量给药后，约3 h小鼠开始死亡，小鼠死亡后马上取出尸体解剖，肉眼观察肝脏表面有黄色或白色斑点，肝脏颜色较空白组浅。组织病理学结果(图1)显示，和空白组(a)比较，LD0剂量组(b)小鼠肝小叶结构尚清楚，部分肝索排列紊乱，肝细胞呈轻度细胞水肿(+);可见肝细胞点状坏死(+)、肝小叶及汇管区见有炎细胞浸润(+)，纤维结缔组织增生不显著;LD100剂量组(c)小鼠肝小叶结构破坏，肝索排列紊乱，肝细胞呈不一样程度脂肪变性、细胞水肿(+);可见肝细胞坏死(+)、肝小叶及汇管区均见有炎细胞浸润(+)。纤维结缔组织增生不显著。a空白组bLD0剂量组cLD100剂量组图1紫菀毒性部位对小鼠肝脏组织形态的影响4讨论紫菀始见于神农本草经，历代本草