PCF反应体系有关的过程姓名： 于烨敏学号：11243220班级：113第一部分1、PCR原料：DNA模板：模板包含要用来扩增的靶基因区域，适当提高模板浓度， 可减少循环次数，从而减少突变的发生和非特异性产物的形成；但过高的模板浓度会降低反应效率。上游引物和下游引物：是人工合成的短的单链 DNA片段(寡核苷酸)，经常由18-30个碱基组成，用来确定扩增区域 的起止位点从而确定扩增的 DNA片段大小；物与要扩增的双链DNA的两端精确互补，在退火 中可以与DNA莫板链特异性地结合。当引物与模板链结合后，DNA聚合酶就开始从引物链的结合位点催化合成新的 DNA链。引物的量不能太多，过多的引物导致非特异性扩增的发生和 引物二聚体的形成。聚合酶：聚合酶从引物结合位点开始沿DNA链移动，阅读DNA编码信息，填充正确的匹配核苷酸，催化DNA新链的合成；来源于生活在热泉中的一种细菌Thermus aquaticus的Taq聚合酶是目前使用最广泛的聚合酶。由于Taq酶没有3-5外切酶活性，在复制 DNA的过程中可能会随机的引入错误的碱基。 对于一般的PCF实验来讲，错误的产生不影响实验的结果；但特定的实验，如扩增的序列是用在测序或蛋白表达等用途时最好使用有较读活性的高保真酶，如Tli或Pfu。由于Taq酶相比其它酶要求的反应条件简单，扩增效率较高，因此可同其它酶 混合起来以提高扩增长片段时的保真性。单独使用高保真酶扩增的产物如果与具有黏性末端的载体相连前，通常利用 Taq酶在产物的3末端增加一个多余的 A碱基。四种 dNTP( dATP, dCTP dGTP和 dTTP):是合成DNA新链的原料。dNTP的量与合成产物的大小有关，越长的片段需要越多的dNTP但过多的dNTP能增加复制的错误率并可能抑制Taq酶活性。缓冲液：为维持DNA聚合酶的活性提供必要的pH值和离子浓度。Mg离子:Mg离子对于维持聚合酶的活性是必须的，它通过稳定引物-模板相互作用而影响退火进程；同时也能稳定聚合酶同引物一模板形成的复制复合物，因此可以增加非特异性退火，进而形成非特异性产物。许多成分如EDTA和dNTP可以结合一部分Mg离子，所以Mg离子准确的用 量需要实验来确定。一般来讲，低浓度的Mg离子增加复制的可信度，而高量的Mg离子降低 特异性、引入突变。一般反应可通过变化温度、模板质和量而规避提高Mg量的操作。添加剂:当模板GC1.7-deaza-dGTP, Glycerol (5-10%), formamide (1-5%) or DMSO (2-10%)含量高时，加入7-deaza-dGTP或DMSO可以降低互补碱基间的氢键从而降低反应需要的有效 退火温度和变性温度。这些添加剂也会改变聚合酶的耐热性，Glycerol可保护聚合酶，防止热失活；而formamide可降低酶的耐热性。2. 0.5-2M Betaine :当模板GC含量高时或扩增长片段时， 加入后可降低变性温度到 92-93 C, 并使退火温度下降2-3 C, Betaine经常跟5 %的DMS(一起使用。3. TMAC (tetramethylam monium chloride), TEAC (tetraethylam monium chloride), andTMANO (trimethlami ne N-oxide);4. BSA :可以提高 PCR反应效率。5. Triton X-100:可防止聚合酶的相互缔合或者黏附在反应管壁上2、图形原理:|話t赴火111塔 | _ 靈 I ，二应 J3，皿贸牺twi环I3、DNA聚合酶说明书：第二部分选取目的基因的具体来源Escherichia coli plasmid pNGX2-Q nrS1, completesequenee（定义）DEFINITIONEscherichia coli plasmid pNGX2-Q nrS1, completeseque nee. ACCESSIONVERSIONDBLINKKEYWORDSSOURCEORGANISMNC_019047 REGION: compleme nt(7133.7555)NC_019047.1GI:410488804Project: 178640BioProject: PRJNA178640RefSeq.Escherichia coliEscherichia coliBacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; En terobacteriales; En terobacteriaceae; Escherichia.REFERENCE 1 (bases 1 to 423)AUTHORSJohnson,T.J., Bielak,E.M., Fortini,D., Hansen,L.H., Hasman,H.,Debroy,C., Nolan,L.K. and Carattoli,A.TITLEExpansion of the IncX plasmid family for improved identificationand typ ing of no vel plasmids in drug-resista nt En terobacteriaceae(改进的识别和耐药肠杆菌科新型质粒分型的相应质粒家庭的扩张)JOURNAL Plasmid 68 (1), 43-50 (2012)PUBMED 22470007REFERENCE2 (bases 1 to 423)CONSRTMNCBI Genome ProjectTITLE Direct Submissi onJOURNAL Submitted (01-NOV-2012) Natio nal Center for Biotech nologyInformation, NIH, Bethesda, MD 20894, USAREFERENCE 3 (bases 1 to 423)AUTHORS Johnson,T.J., Bielak,E.M., Fortini,D., Hansen,L., Hasman,H.,Debroy,C., Nolan,L.K. and Carattoli,A.TITLE Direct Submissi onJOURNALSubmitted (09-DEC-2011) Departme nt of In fectious, Parasitic andImmuno-Mediated Diseases, Istituto Superiore di Sanita, Rome,ItalyCOMMENT to finalFEATURESsourcegenePROVISIONAL REFSEQ: This record has not yet bee n subjectNCBI review. The reference seque nee is ide ntical to JQ269335. COMPLETENESS: full len gth.Locati on/Qualifiers1. 423/orga ni sm二Escherichia coli/mol_type=ge no mic DNA/strai n=Z7/host二poultry/db_xref二taxon :562/plasmid二pNGX2-Q nrS1/co un try二Nigeria: Ibada n1. 423/locus_tag=D616_p1010/db_xref=Ge nelD:13903681二、大肠杆菌质粒DNA勺提取：1、 碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒 DNA可直接用于酶切、PCR 扩增、银染序列分析。方法如下：(1 )、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于 2ml LB培 养基。(2) 、37C振荡培养过夜。(3) 、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min,弃上清液。(4) 、力口 0.1ml 溶液 1(1 %葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0, 25mM/L Tris-HCl pH8.0) 充分混 合。(5) 、加入0.2ml溶液ll(0.2 mM/L NaOH , 1 % SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴 5 min 。(6) 、加入0.15m1预冷溶液lll(5 mol/L KAc , pH4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min。(7) 、以10, 000rpm离心20min，取上清液于另一新 Ep管(8) 、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0 C静置10min。(9) 、再以10, 000rpm离心20min，弃上清。(10) 、用70%乙醇0. 5ml洗涤一次，抽干所有液体。(11) 、待沉淀干燥后，溶于 0. 05mlTE缓冲液中2、煮沸法(1 )、将1.5ml培养液倒入 eppendorf管中，4C下12000g离心30秒。(2) 、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。(3) 、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中，涡旋混匀。、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml),涡旋振荡3秒钟。(5)、将eppendorf管放入沸水浴中，50秒后立即取出。、用微量离心机4C下12000g离心10分钟。、用无菌牙签从eppendof管中去除细菌碎片。（8）、取20ml进行电泳检查。注意1.对大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取质粒DNA。2.煮沸法中添加溶菌酶有一定限度，浓度高时，细菌裂解效果反而不好。有时不同溶菌酶也能溶菌。3.提取的质粒DNA中会含有RNA,但RNA并不干扰进一步实验，如限制性内切酶消 化,亚克隆及连接反应等。【质粒DNA的大量提取和纯化】在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA,为此需要大量提取质粒DNA。大量提取的质粒 DNA 一般需进一步纯化，常用柱层析法和氯化绝梯度 离心法。（一）、碱法1、 取培养至对数生长后期的含pBS质粒的细菌培养液250ml, 4C下5000g离心15分钟, 弃上清，将离心管倒置使上清液全部流尽。2、 将细菌沉淀重新悬浮于 50ml用冰预冷的STE中（此步可省略）。3、同步骤1方法离心以收集细菌细胞。4、将细菌沉淀物重新悬浮于 5ml溶液I中,充分悬浮菌体细胞。5、 加入12ml新配制的溶液II,盖紧瓶盖，缓缓地颠倒离心管数次，以充分混匀内容物，冰 浴10分钟。6、 加9ml用冰预冷的溶液 山，摇动离心管数次以混匀内容物，冰上放置15分钟，此时应形 成白色絮状沉淀。7、4C下5000g离心15分钟。8、取上清液，加入50ml RNA 酶A（10mg/ml）, 37 C水浴20分钟。9、 加入等体积的饱和酚/氯仿，振荡混匀，4C下12000g离心10分钟。10、取上层水相，加入等体积氯仿，振荡混匀，4C下12000g离心10分钟。11、取上层水相，加入1/5体积的4mol/L NaCl和10% PEG（分子量6000）,冰上