艾草中黄酮类化合物的提取步骤一、试验仪器及药品1 试验仪器：天平、紫外分光光度计、恒温水浴锅、小鼠固定器、灌胃器、恒温干燥箱、真空抽滤机、毛细血管、容量瓶、移液管等。2 试验药品：盐酸、乙醇、芦丁标品、 5%亚硝酸钠溶液、 10%硝酸铝溶液、 1 mol/L 氢氧化钠溶液、阿司匹林、生理盐水二、技术路线技术路线 1：艾草采集 干燥 粉碎 过筛 浸提 趁热抽滤 2 次合并滤液冷却 黄酮类粗品 乙醇重结晶 冷却 黄酮类化合物精品技术路线 2：小鼠编号分组 灌胃给药 毛细血管静脉取血 观察并记录凝血时间技术路线 3：小鼠编号分组 灌胃给药 小鼠断尾 观察并记录凝血时间三、实验步骤：（一）艾草中黄酮类化合物的提取工艺研究分别以液料比（艾草质量：溶剂体积）、浸提温度、浸提时间 3 个方面进行单因素实验，以黄酮类化合物的提取率为指标，确定单因素的合适范围，然后做单因素正交实验，确定最佳的提取工艺组合。1、艾草中黄酮类化合物粗提取液的制备 艾草采集：采取 8 月中旬的艾草。1 / 5 干燥：以风干为最佳干燥方法。 浸提：准确称取 1g 艾草粉末，加约6 倍量已煮沸的蒸馏水，搅拌下加饱和石灰水调 pH 至 89，并保持此 pH 下微沸 4050min。 合并提取液：在 8090，搅拌下用盐酸调 pH45，静止，沉淀完全抽滤，水洗至洗液呈中性， 60干燥至恒重。 乙醇重结晶：收集干燥得黄酮粗提物，加 500mL 已煮沸的蒸馏水，加热煮沸 20min 至溶液澄清，趁热过滤，收集滤液，放置充分冷却，沉淀完全抽滤，水洗至洗液呈中性，沉淀 60干燥至恒重。2、黄酮含量测定：（ 1）制备标准曲线：取干燥恒重芦丁配成浓度为0. 065 mg/mL 标溶液 ,取上述标准溶液0. 0,2. 0,4. 0,6. 0,8. 0,10. 0 mL,分别置于 25 mL 容量瓶中 ,加 30%乙醇补足至2 / 512. 5mL,加 5%亚硝酸钠溶液0. 7mL 摇匀 ,放置 5min 后,精确加入 10%硝酸铝溶液0.7mL 摇匀 ,放置 5min,精确加入 1mol/L 氢氧化钠溶液 5 mL,用 30%乙醇稀释至刻度。以第 1 容量瓶为空白 ,于 510 nm 波长下测定吸光度 ,以吸光度为坐标，浓度为横坐标 ,绘制标准曲线 ,建立回归方程。（ 2）黄酮类化合物的测定：取提取液0. 1 mL,置于 25 mL 容量瓶中 ,加 30%乙醇补足至12. 5 mL,加 5%亚硝酸钠溶液0. 7 mL 摇匀 ,放置 5 min 后,精确加入 10%硝酸铝溶液0. 7 mL 摇匀 ,放置 5 min,精确加入 1 mol/L 氢氧化钠溶液 5 mL,用 30%乙醇稀释至刻度。以0. 1 氧化钠溶液 5 mL,用 30%乙醇稀释至刻度。以0. 1mL 30%乙醇为空白 ,于 510 nm 波长下测定吸光度 A,由标准曲线得对应浓度 C,可算得艾草样品的总黄酮含量。3、黄酮化合物提取优化试验（ 1）单因素试验 液料比： 80水浴浸提 3h，液料比分别为1:15、1:20、1:25、1:30、1:3 / 535、1:40 条件下提取艾草中黄酮化合物，以黄酮化合物的提取率为指标，研究液料比对黄酮提取效率的影响。选取对黄酮提取率影响较大的范围，用于正交试验。 浸提温度：液料比 1:25 水浴浸提 3h，温度分别为 60、70 、80、90、100条件下提取艾草中黄酮类化合物，以黄酮化合物的提取率为指标，研究温度对黄酮提取效率的影响。选取对黄酮提取率影响较大的范围，用于正交试验。 浸提时间： 80水浴、液料比 1:25，时间分别为1h.、1.5h 、2h、2.5h 、3h、3.5h 条件下提取艾草中黄酮化合物，以黄酮化合物的提取率为指标，研究液料比对黄酮提取效率的影响。选取对黄酮提取率影响较大的范围，用于正交试验。（ 2）正交试验以（ 1）单因素试验中的数据进行L9(33)正交试验。（二）艾草中黄酮类化合物的凝血试验 小鼠分组：将 50 只 2 周龄的小鼠随即分成 5 组，分别为：空白对照组（生理盐水0.2mL/10g（体重），阳性对照组（20mg/kg 阿司匹林），5.0、10.4 / 50、15.0g/ 黄酮类化合物组。 灌胃给药：按照步骤 所述条件，用针管将生理盐水、阿司匹林、各浓度黄酮类化合物注射到小鼠嘴内，每天 2 次，连续 3d。 毛细管静脉取血：末次给药 1h 后，用内径 1mm 毛细管插入小鼠内龇静脉丛中取血，血液注满毛细管后轻轻放于桌面。 观察并记录凝血时间：从血液开始流入毛细管开始计时，每隔 30s 打断毛细管，观察断裂处有无凝血丝的出现，一旦出现则说明凝血，停止计时，记录时间，即为凝血时间。（三）、艾草中黄酮类化合物的出血试验 、 于二中的 、 相同。 小鼠断尾：小鼠固定于固定器中，使其尾巴自然下垂，距离尾尖1mm 处剪断。 观察记录凝血时间：剪断小鼠尾巴开始计时，每隔 30s 用滤纸轻吸尾尖血液，直至血液自然停止（滤纸吸不出血液），记录断尾至出血停止时间，即为出血时间。5 / 5