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金鱼草植株再生体系的建立1、金鱼草高效转化途径为1:余迪求,邓庆丽等人曾采用金鱼草下胚轴为外植体,建立不定芽发生系统,并在此基础上 进一步以下胚轴为转化受体进行农杆菌 Ti 质粒介导法将外源基因导人金鱼草细胞,成功地 获得开花的转基因植株2-4。由于金鱼草的无菌苗生长势极弱,从而导致以下胚轴为外植体 进行农杆菌 Ti 质粒介导法进行基因转化时,因下胚轴太小太细,在操作时往往将其伤害严 重,再加上农杆菌的侵染作用,外植体的共培养阶段几乎全部死亡,从而使再生率和转化率 大大下降,为金鱼草的基因转化工作增加了难度。因此,本实验研究所采取的金鱼草植株再生体系参照黄俊轩,李建科等人的方法如下:挑选饱满的金鱼草种子,经消毒处理后得到无菌苗切取无菌苗下胚轴接种到MS+2.0mg/L BA+0.2 mg/L NAA分化培养基上诱导出再生芽将下胚轴再生的芽接种到增粗培养基1/2MS+1.0mg/L BA+0.2 mg/L IAA上,得到长势粗壮的金鱼草组培苗7以组培苗茎段为金鱼草基因转化的外植体进行遗传转化,转化所用的 诱导再生培养基为MS+2.0mg/L BA+0.2 mg/L NAA2、消毒、培养无菌苗的具体步骤:种子用70 %酒精浸泡2 min ,用含10 %次氯酸钠的0.5 %SDS灭菌5 min ,再用无菌水冲洗45次后,接种在MS基本培养基+3 %蔗糖+0.8 %琼脂的固体培养基上。培养温度201 C,每天光照14 h ,光照强度1 600 lx ,以准备无菌苗。(姜维梅、梁海曼等)3、MS 培养基的配置:1、配制几种母液(1)配制 MS 大量元素母液一般将大量元素分别配制成20倍的母液,使用时再稀释20倍。分别称取名称重量名称重量NHNO4333gKHPO423.4gKNO338gCaCl 2H O228.8g(单独一瓶)MgSO 7H O7.4g各自配成1L的母液。各自倒入1L试剂瓶中,存放于4C冰箱中。2)配制 MS 微量元素母液一般将微量元素配制成 100 倍母液。依次称取(注:溶好-个后,再加下一个)名称重量名称重量KI0.083gNaMoO242H O20.025gHBO330.62gCuSO 45H O20.0025gMnSO H O421.69gCoCl 26H O20.0025gZnSO 7H O0.86g配成1L母液,倒入1L试剂瓶中,存放于冰箱中。注:CuSO5H O和CoCl6H O由于称取量很小,如果天平精确度没有达到万分之一,可先配成调整液。4222分别称取 CuSO 5H O 0.5g, CoCl 6H O 0.5g4222各自配成 100ml 的调整液,然后取 500ul 就还有 0.0025g 的量。(3)配制 MS 有机母液一般配制成 100倍 MS 有机母液。依次称取(注:溶好一个后,再加下一个)名称重量名称重量肌醇10g盐酸硫胺素(VB1)0.01g烟酸0.05g甘氨酸0.2g盐酸吡哆醇(VB6)0.05g配成1L母液,倒入1L试剂瓶中,存放于冰箱中。4)配制 MS 铁盐母液一般配制成100倍MS铁盐母液。依次称取EDTA二钠3.73g,FeS047屯0 2.78g (注:溶好一个后,再加下一个) 配成1L母液,倒入1L试剂瓶中,存放于冰箱中。5)激素母液的配制各种生长素和细胞分裂素要单独配制,不能混合在一起,生长素类一般要先用少量95% 的酒精或1当量的NaOH溶解,细胞分裂素一般要先用1当量的盐酸溶解,然后再加蒸馏水 定容。一般取100mg配成100ml母液。2、配制培养基以配置1L MS培养基为例,按顺序进行如下操作:(1)先在烧杯中放入一些(约800m 1)蒸馏水。( 2) 分别取上面母液按所需稀释的倍数吸取对应的体积数倒入。(3)一般称取30g蔗糖(scurose)倒入,搅拌溶解。(4)加蒸馏水用量筒定溶至 1L。(5)按设计好的方案添加各种激素,由于激素的用量很小,而且激素对组培植物的生长 至关重要。所以有条件的话最好用微量可调移液器吸取,减少误差。(6)用精密试纸或酸度计调整PH至5.7-5.8。(有条件的话使用酸度计,比较精确)可 配1当量的HCL和1当量的NaOH用来调溶液PH值。1当量HCL配制:用量筒量取& 3ml配成100ml溶液。1当量NaOH配制:称取NaOH 4g配成100ml溶液。(7)称取质量分数0.5%左右琼脂粉(Agar),倒入分装的各个试剂瓶中。(8)将定容好的 MS 溶液分装入各个试剂瓶中(用量筒、量杯)用封口膜或牛皮纸封口, 用橡皮筋或绳子扎紧。(9)放入消毒灭菌锅1219灭菌,灭菌20分钟左右。(10)灭菌后从灭菌锅中取出培养基,平放在实验台上令其冷却40-509左右,在超净台 上分装到每个组培瓶中 40ml 左右。4、目前实验进展:2 0 1 4年7月1 5日购买金鱼草种子1 0 0颗,其中有50颗用来直接种植,观察出芽率。 发现出芽率只有30-40%左右,剩下50颗于2014年7月26日用来培养金鱼草的无菌苗。培养无菌苗的具体方法:种子在经上述方法消毒、灭菌冲洗后,分别在每个装有基础MS培 养基的组培瓶中,点种金鱼草种子4颗,间隔分开种子落在培养基的表面,瓶口封好封口膜, 放置光照恒温培养箱中培养。光照14小时,黑暗10小时,恒温21-22度。一共培养12瓶。经过15-16天的培养后,共发芽并得到无菌苗23颗,其中一瓶染菌2颗,这样可用金 鱼草无菌苗共21颗,长势良好,株高2-3cm左右。分化培养基已经配好,分装到60个组培瓶中,分别取无菌苗的上胚轴、中胚轴、下胚 轴,切取1-2cm左右,每个瓶中培养一个胚轴,培养基为分化培养基:MS+2.0mg/L BA+0.2 mg/LNAA,诱导出再生芽,生长16-18天左右后,统计再生率。参考文献1 黄俊轩,李双跃,李建科等金鱼草高效植株再生体系的建立J.安徽农业科学,2007, 35(20):6039-60402 余迪求,邓庆丽,沈亚楠等金鱼草下胚轴组织培养的研究J.田园艺学报, 1996(23):99-100.3 余迪求,邓庆丽,沈亚楠等.金鱼草基因转化和转基因植株再生J.热带亚热带植物学 报, 1996 ,4(4):86-90.4 姜维梅,梁海曼,种华鑫.金鱼草下胚轴不同部位切段形态发生能力的研究J.云南植物 研究, 1999,21(1):109-11.5 李竹英,钱艳红,毛绍春.不同激素对金鱼草茎尖组织培养效果初探J.北方园艺,2006 (3):130131.
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