甘肃农业大学 2012届本科毕业论文本科毕业论文题 目 甘肃金鳟IGF-单核苷酸多态性分析学 院 生命科学与学院技术 专 业 生物技术（制品方向） 毕业届别 2012 姓 名 许尔柱 指导教师 苏军虎 职 称 讲师 甘肃农业大学教务处制二一 二 年 五 月目 录摘要2关键词2Abstract3Key word3引言31 材料和方法41.1 材料来源41.2引物设计与合成41.3 基因组DNA的提取51.4 PCR扩增反应51.5 PCR变性51.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳51.7电泳结果处理52 结果与分析62.1 IGF-基因引物P5的SNPs分析62.1.1 PCR扩增结果62.1.2 SSCP检测结果62.2 IGF-基因引物P6的SNPs分析72.2.1 PCR扩增结果72.2.2 SSCP检测结果72.3 IGF-基因引物P7的SNPs分析72.3.1 PCR扩增结果72.3.2 SSCP检测结果82.4 IGF-基因物P8的SNPs分析82.4.1 PCR扩增结果82.4.2 SSCP检测结果93 讨论9致谢10甘肃金鳟IGF-单核苷酸多态性分析许尔柱（甘肃农业大学生命科学技术学院，兰州730070）摘要：甘肃金鳟是中国自主培育的虹鳟新品种，为进行其种质资源研究，以其尾鳍为试验材料，提取基因组DNA，通过PCR-SSCP技术对其IGF-2基因进行单核苷酸多态性分析。经过对实验结果的分析，四种引物中P6引物所扩增的片段检测出存在突变点的基因型较多，我们应更加深入进行这方面的研究，以便能更好的为今后甘肃金鳟遗传改良、资源保护、开发利用和科学管理以及新品种的培育奠定基础。关键词：甘肃金鳟；单核苷酸多态性；胰岛素生长因子2Analysis of Single Nucleotide Polymorphisms in Gansu goldenTrout IGF-2Xu Erzhu(College of Life Science and Technology, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070)Abstract:Gansu Rainbow Trout is a New varieties of Rainbow trout which is cultivated by china , in order to research its Germplasm resources,we make its Caudal fin as test material,and extract geonmic DNA,and analyze its Single Nucleotide Polymorphisms of Gene IGF-2 with the technology of PCR-SSCP. After analyzing the result,we think the primer P6 is the most suitable primer of four primer,wo should make more research of Gansu goldenTrout IGF-2,then ,wo can Lay a foundation of Genetic improvement, resource protection, exploitation and scientific management and the cultivation of new varieties of Gansu golden Trout in future.Key word:Gansu goldenTrout ；Single Nucleotide Polymorphisms；insulin-like growth factor 2引言 甘肃金鳟是甘肃省水产科技工作者历经15年以虹鳟的突变体为材料选育而成的新品系1，是以冷水性鱼类虹鳟的突变体为材料选育而成的一个鱼类新品种,在分类学上属鲱形目、鲑科、鳟属2，2006年通过全国水产原种和良种审定委员会审定，其与目前国内外养殖的道氏虹鳟、日本金鳟相比，体色更艳丽，眼球血红具有很好的观赏价值，且性情温顺、生长快、抗病力强、耐氧低，是适应中国西北地区的特色冷水养殖品种2007年4月甘肃金鳟被农业部列为适宜在全国具冷水资源的地区养殖的优良品种。甘肃金鳟优良的性状吸引了很多人的研究以期望对其进行改良从而更好的产生社会和经济效益，包括其人工繁育养殖技术3、生物学特性4、肌肉成分分析5等都研究的很全面和成熟了，而有关甘肃金鳟分子水平上的遗传特性研究,却很少有学者进行报道。 胰岛素样生长因子 2(insulin-like growth factor 2,IGF2)作为胰岛素样生长因子家族成员之一, 是一种促细胞分裂多肽, 可介导生长激素发挥作用、刺激培养细胞生长, 在发育中具有促生长的重要功能6。本研究采用PCR技术、聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对IGF-2进行单核苷酸多态性分析，通过对相同品种、不同个体之间单个核苷酸的差异比对来评估甘肃金鳟人工养殖群体的遗传变异水平便于对其进一步改良提供理论依据。1 材料和方法1.1 材料来源 实验材料 实验用甘肃金鳟采自甘肃省临夏国家级鲑鳟鱼良种场，随机采集200尾(雌雄各半)，剪尾鳍约0.5 g，采用常规的酚氯仿法提取基因组DNA并测定其OD值，取100L双蒸水溶解，再经1%琼脂糖凝胶电泳检测后确定纯度和浓度，检测完毕后取20uL基因组DNA保存于4的冰箱供使用，余80L基因组DNA保存于-20的冰箱中备用。 主要试剂 dNTP、Taq 酶、10TaqBuffer、Mg2+（购自大连宝生物公司）；引物合成（上海生工生物工程有限公司），蛋白酶K（Proteinase K）购自MMERCK公司1.2引物设计与合成采用Primer 5.0和oligo 6.0 引物设计软件，根据NCBI发表的虹鳟的的IGF-的cDNA序列分别设计4对引物用于甘肃金鳟IGF-SNP 位点的查找。表2-2甘肃金鳟IGF-基因引物信息Table. 2-2 The primers of IGF-gene of Gansu golden trout引物Primer上游/下游引物序列（5-3）Primer sequence（5-3）产物长度（bp）length of products退火温度()annealing temperature用处purposeP5F:GCAACCTCTCCAACCAAAR:TCCACATAGCGTTTCTGCC221 bp56.5筛选SNPs位点filter SNPs siteP6F:TATGTGGAGGAGAACTGGTGGR:TTGGCAGGTTTGGCACAG181 bp59筛选SNPs位点filter SNPs siteP7F:GGTGCCCACAATCAAACAGR:TGGAACATCGCCTGCTCT180 bp58.5筛选SNPs位点filter SNPs siteP8F:ATTTCTGTGGCAAGTCCTCGTR:TGTGTCGGTGAATGAAAGAGAGAG224 bp59筛选SNPs位点filter SNPs site注： F是正向引物;R是反向引物。1.3 基因组DNA的提取 取0.5 g尾鳍剪碎,加入500L裂解液,37消化1 h,之后加入蛋白酶K(20 mg/mL)55消化12 h,待冷却后加等体积酚饱和溶液缓慢转动混匀抽提,12 000 r/min离心5 min,吸上清,用酚-氯仿-异戊醇(体积比25241)抽提2次,最后用氯仿-异戊醇(体积比241)抽提1次,将上清加入2倍体积的无水乙醇沉淀,12 000 r/min离心2 min,再用无水乙醇洗涤2次,离心干燥机抽干,加入适量的1/10 TE (10 mmol/L Tris-HCl, pH 8. 0; 1mmol/L EDTA,pH 8.0)缓冲液溶解,于-20保存备用.DNA浓度通过紫外分光光度计和电泳-EB染色的荧光强度双重测定.1.4 PCR扩增反应 采用优化后的PCR体系：总体积25L，含2.5L5buffer,dNTP混合液0.5L，taqE0.6L，引物2L，蒸馏水19L,模版DNA1L。反应条件为：94预变性4 min,94变性45 s，56.5、59、58.5、59复性50 s、72延伸50 s,共35个循环,最后72充分延伸7 min.扩增反应物在1.4 %琼脂糖凝胶中电泳,最后经EB染色,紫外透射仪上拍照.注：56.5、59、58.5、59复性50 s分别对应引物P5、P6、P7、P8的复性温度。1.5 PCR变性 将扩增好的PCR产物2.5L、变性buffer2.5L混匀放入PCR仪进行PCR变性11分钟，变性温度为94。1.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳 取PCR变性产物3L滴于聚丙烯酰胺凝胶电泳加样孔，将电压设为80V，电流为60mA，进行电泳。同时用冰袋围住电泳仪，直至电泳结束。1.7电泳结果处理 电泳结束后，将制得的胶取出，先用固定液（40ml乙醇，360ml蒸馏水，2ml冰乙酸）固定8分钟，接着用染色液（硝酸银1g，无水乙醇50ml，乙酸2.5ml，定容至500ml）染色8分钟,再用显色液（氢氧化钠15g，定容至500ml）显色8分钟，显色前应在显色液里加2.5ml甲醛。2 结果与分析2.1 IGF-基因引物P5的SNPs分析2.1.1 PCR扩增结果用引物P5对标记的甘肃金鳟所有个体进行PCR扩增，经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，扩增片段长度与预期的片段大小一致（221bp），且无非特异性扩增（见图3-10），可以直接进行SSCP检测。500300200100图3-10引物P5对甘肃金鳟IGF-基因序列的扩增检测结果图Fig.3-10 Result of the PCR fragments using Primers P5 on Gansu Rainbow Trout2.1.2 SSCP检测结果 将PCR产物加变性上样缓冲液后用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶，4进行电泳，检测到IGF-第一外显子引物P5扩增片段中的突变点存在2种基因型AA和AC，未发现CC，结果（见图3-11）图 3-11 引物P5对甘肃金鳟IGF-基因的PCR-SSCP检测结果Fig.3-11 Detection of gene IGF- in Gansu Rainbow Trout by PCR-SSCP2.2 IG