水稻愈伤组织的诱导一、实验目的1、掌握外植体的消毒方法和接种技术；2、了解愈伤组织诱导的过程。二、实验原理以植物器官、 组织、细胞等作外植体进行离体培养时， 在一定的诱导培养条件下都 能诱导形成愈伤组织。 愈伤再经分化培养， 通过器官发生途径或体细胞胚胎发生途径可 再生成植株。外植体源自自然环境均为带菌状态， 在接种前都必须进行消毒。 对于难消毒的材料， 有时要几种消毒剂配合使用； 对于多茸毛表面粗糙不平的材料， 要加展着剂 （吐温 20） 以增强消毒效果。三、实验材料与用具1、材料：水稻成熟种子（用于诱导愈伤组织） ；2、 试剂：75%酒精，2% NaCLQ无菌水（每组1瓶400mL）;3、培养基： 诱导培 养基： NB+2,4-D 2mg/L+蔗糖 30g/L+琼脂 8g/L （）;4、仪器设备：培养室、超净工作台、培养皿（C 9cm） 2个、枪形镊、量筒（100mL） 2个、三角瓶（50mL、无菌）2个、废液缸、保鲜膜、标签纸。四、实验步骤1 、接种室、培养基及用具表面消毒用 75%酒精棉球试擦超净工作台、镊子，将培养基及用具放工作台，打开紫外灯， 照射 20分钟以表面消毒。之后关紫外灯，打开工作台风机，通风 30分钟后可进行无 菌操作。2、种子去壳 选取饱满、无霉变、成熟的水稻种子，手工脱去谷壳（注意保持胚完整） ，每人准 备 30 粒去壳种子，并按照分组放到三角瓶中。3、操作者双手的清洗与消毒在进入无菌室之前，各操作者先用自来水清洗干净双手并晾干，然后进入无菌室,坐在超净台前位子上后，用含 75%酒精的酒精喷壶喷洒双手对双手进行消毒，在超净 台风口待双手酒精风干后进入超净工作台。（注意：酒精喷壶喷洒双手时切记不要把酒精喷到超净台的有机玻璃板上！）4、超净台面的表面消毒（以下工作在超净工作台内进行）用枪形镊子从含75%酒精棉球的容器中取一团棉球，仔细把整个超净台面擦试一遍，尽量降低超净台面的带菌量，并将废棉球丢到废液缸中，然后点亮超净台里面放置的酒精灯。5、外植体消毒（分组操作，每组由一位代表操作完成外植体的消毒工作） 将脱谷壳米粒转到一 50mL无菌三角瓶一加适量无菌水洗一次（以没过种子为准,下同）一弃水，倒入75%酒精适量，摇动搅拌，放置30秒（过程中适当轻摇动混匀） f弃酒精f加适量无菌水洗一次f弃水f倒入适量2% NaCLQ不时摇动搅拌，共处理30分钟一弃NaCLS用无菌水洗3次，每次停留1分钟一倒去无菌水，将种子从三角 瓶转到带无菌滤纸的无菌培养皿中吸干。6、接种与观察将吸干的消毒种子用无菌的镊子接入培养基并均匀放置，每皿接10粒，每人共接种2皿。接种完成后，将培养皿盖上并用保鲜膜封口，然后将接种有材料的培养皿移出超净台，贴上标签写明日期、接种人，按照班级统一放入一篮子，再将篮子放入培养室进行25C暗培养。注意每隔2-3天前来观察一次实验现象，1周后调查计算污染率，14天后调查计算愈伤组织诱导率。污染的种子数污染率（）=接种的总种子数% 100%诱导率（%）=形成愈伤组织的种子数接种的总种子数x 100%五、实验结果本次实验我组未出现被污染的种子，污染率均为0。说明实验过程中，我组成员操作规范，保证所接种的种子均不受到污染。最后，我组的2个培养皿分别可以诱导出7和8株水稻苗，诱导率分别为70%和80%六、讨论与分析1、 本实验出现污染的原因分析。1) 外植体消毒不彻底，表面有较多微生物残留；2) 实验用具如镊子等消毒不彻底，在操作过程中把微生物带到种子上，污染 种子；3) 实验前，超净工作台没有充分消毒，台内(主要是空气中)还残留有较多 微生物；4) 培养皿密封措施做得不好，致使培养期间有微生物进入到培养皿中，并生 长繁殖。2、 降低实验中的污染率的方法。1) 外植体、实验用具、超净工作台均需彻底消毒；2) 做好密封措施；3) 操作时勿离酒精灯太远；4) 尽量缩短操作时间；5) 定时更换消毒液( 75%酒精、 2% NaCLO)。3、 分析与愈伤组织诱导形成有关的因素。1) 外植体的状态(分化的程度) ；2) 诱导培养的环境(光线、水分、温度等) ；3) 植物激素的作用。