.水泡性口炎病毒在草鱼肾细胞中的复制和病变效应摘要：目的 观察水泡性口炎病毒Vesicular stomatitis virus ,VSV感染草鱼肾细胞CIK细胞所引起细胞病变效应并检测其在细胞中的复制。方法用VSV病毒印第安纳VSV Indiana株感染CIK细胞,分别在12h、24h、36h观察病变效应。当出现大范围的细胞病变时,提取病毒RNA,通过RT-PCR方法检测病毒在细胞中的复制。结果 受VSV病毒感染后的CIK细胞圆缩、聚集、脱落,形成包涵体,随着时间的延长该现象逐渐加剧。RT-PCR结果显示出现了预期的200bp左右的条带。结论 VSV病毒引起了CIK细胞的病变,并在CIK细胞中进行了复制。关键词：VSV病毒,CIK细胞,病变效应,复制Vesicular Stomatitis Virus in Ctenopharyngodon IdellusKidney CellsReplication and Cytopathic Effect06092204GAO Xia-TingAbstract:ObjectiveWe observed cytopathic effectin Ctenopharyngodon idelluskidney cells induced by Vesicular stomatitis virus anddetected VSVs replication in it. MethodsCIK cells were infected byVSV Indiana strains. After 12h, 24h, 36h, the cell cytopathic effect was observed. When a wide range of cytopathic effect appeared, the viruss RNA would be extracted and detected by RT-PCR. ResultsCIK cellswith VSV became round shrinkage, got together, shaded, and formed inclusion body. With the extension of time,it increased. RT-PCR resultshowed that the expected bands of 200bp were amplified with templates of viruss RNA. Conclusion Cytopathic effect appeared in CIK cellswith VSV. And VSV could reproducein CIK cells.Key words:VSV,CIKcells, cytopathic effect, replication目 录1 引言12 实验材料和方法2 2.1材料22.1.1实验细胞 主要化学药品和试剂主要仪器与设备试剂配制2.2 方法与步骤42.2.1草鱼的肾细胞培养VSV病毒的复壮与效价检测细胞病变效应2.2.4病毒RNA提取及RT-PCR测定草鱼肾细胞中VSV的复制2.2.5空斑实验3 结果与分析10 3.1正常草鱼的肾细胞CIK细胞培养特征113.2水泡性口炎病毒VSV病毒的复壮11 3.3VSV病毒感染草鱼肾细胞CIK细胞不同时间后产生的细胞病变效应11 3.4 RT-PCR检测VSV病毒在CIK细胞中的复制12 3.5空斑试验134 讨论13 4.1 VSV病毒对不同细胞系引起病变效应13 4.2VSV病毒对Vero细胞、3T3细胞、CIK细胞的空斑实验结果的比较144.3 VSV病毒的检测方法155 总结与展望15 参考文献16 致 谢17.1. 引言VSV病毒为弹状病毒科Rhabdoviridae,水泡病毒属vesiculovirus成员。其有两个血清型即水泡性口炎病毒印第安纳VSV Indiana株和新泽西VSV-New Jersey株1。以节肢动物为媒介传播,可以感染啮齿类动物及牛、猪、马等多种动物,也可以感染人类2。VSV病毒引起的水泡性口炎Vesicular stomatitis,VS是一种急性高度接触性传染疾病,以马、牛、猪等动物较易感染,绵羊和山羊也可感染。临床上以舌、唇、口腔黏膜、乳头和蹄冠等处上皮发生水疱为主要特征,还有糜烂及溃疡3,其症状与口蹄疫、猪水疱病相似4。人也有感染VS,引起流感样症状。本病被国际兽疫局列为A类疾病。在我国VS为外来动物病,国家进出境动物检疫对象中将VS列为二类疫病。随着经济发展的国际化,动物及动物产品的国际贸易量逐渐增加,外来动物病传入我国的风险日益加大。为防止国外动物疫病入境,保护我国畜牧业及水产业的健康发展,对该病进行充分的了解和研究具有特别重要的意义,尤其是对病原VSV病毒的研究。VSV病毒几乎可在所有常用的实验室培养细胞内生长,包括鸡胚细胞以及牛、猪、恒河猴、豚鼠以及其它动物的原代肾细胞,可以很快引起明显的细胞病变效应CPE,18-24h即可引起细胞快速圆缩、聚合、脱落,可在动物的原代肾细胞单层上产生不同大小的蚀斑,而感染昆虫细胞则引起持续性感染,无细胞病变。VSV病毒的诊断方法较多,包括病毒的分离培养、电镜观察、琼脂免疫扩散、免疫电泳、酶联免疫吸附试验、补体结合试验、中和试验、聚合酶链式反应等。OIE推荐夹心ELISA 、CF用于鉴定病毒抗原,液相阻断ELISA、VN、CF则用于血清学试验。而PCR法则是近年来发展起来是一种快速、高敏感、准确的诊断技术5。该法全部试验可在1d内完成,能够达到快速诊断的目的,并且具有很好的特异性与重复性,国内外都有相关的研究报道。目前,国内外有关关鱼类病毒的研究包括鲑草梅病毒、淋巴囊肿病毒、系统性虹彩病毒、斑点叉匙回病毒病、银大麻哈鱼疙疹病毒、传染性胰坏死病毒病、鰤鱼腹水病、传染性造血器官坏死病毒、春季鲤病毒、白斑狗鱼幼鱼弹状病毒、草鱼出血病病毒等。但是关于VSV病毒对鱼类影响方面的报道并不多,因此研究该病毒对鱼类的影响成为了一个迫不及待的课题。本实验用VSV Indiana株侵染CIK细胞单层,分别于12h、24h、36h后用倒置显微镜观察细胞病变效应并拍照记录比较不同时段的特征,发现VSV病毒不能在CIK细胞单层上产生蚀斑,同时用RT-PCR方法检测VSV病毒在CIK细胞中的复制。为VSV病毒的进一步研究奠定了基础。2. 材料与方法2.1材料 病毒和细胞VSV病毒、CIK细胞均由XX师范学院细胞研究所实验室提供。2.1.2主要化学药品和试剂表 2-1 主要化学药品和试剂名称纯度来源DEPC生化试剂SERVAEDTA分析纯国药集团化学试剂NaOH分析纯国药集团化学试剂无水乙醇分析纯国药集团化学试剂异戊醇分析纯国药集团化学试剂氯仿分析纯国药集团化学试剂异丙醇分析纯国药集团化学试剂RNase A生化试剂生工生物工程溴化乙锭EB生化试剂SIGMAAgarose生化试剂Bio Basic IncDNA marker DL2000生化试剂Bio Teke 生物公司Taq酶生化试剂TaKaRa公司M-Mulv生化试剂Fermentas公司dNTP混合物、引物生化试剂invitrogen bio-technology公司NaHCO3分析纯国药集团化学试剂丙酮酸钠分析纯国药集团化学试剂高糖DMEM生化试剂Gibco小牛血清生化试剂XX四季青胰蛋白酶生化试剂Amresco青霉素生化试剂美国Sigma试剂公司链霉素生化试剂美国Sigma试剂公司L-谷氨酰胺生化试剂国药集团化学试剂KCl分析纯国药集团化学试剂Na2HPO4分析纯国药集团化学试剂KH2PO4分析纯国药集团化学试剂NaCl分析纯国药集团化学试剂2.1.3 主要仪器与设备表 2-2 主要仪器与设备仪器名称型号厂家梯度PCR仪Eppendorf AG22331Eppendorf核酸扩增仪EPS-100上海天能核酸扩增仪M.J.Research PTC-200凝胶成像系统Dolphin-DOCWEALTEC制冰机YBX70KSGRANT可调移液器0.5-10l芬兰Lab system可调移液器20-200l芬兰Lab system可调移液器100-1000l芬兰Lab system超低温冰箱MDF-4086S日本三洋高温恒温培养箱MIR-162日本三洋超级恒温水浴锅DKB-501AXX省科学器材进出口公司干式恒温机K308XX蓝焰科技台式离心机TGL-16G上海安亭科学仪器厂台式高速离心机BiofugePrimor德国Heraeus多功能旋涡混合器WH-966太仓科教器材厂1/10000电子天平AL104上海安亭科学仪器厂CO2培养箱RC03000T-5-VBC上海博迅倒置显微镜MoticAE20Motic荧光倒置显微镜090-134.010-000德国莱卡超净工作台SW-CJ-2FDXX净化设备液氮罐YDS-30XX金凤液氮容器超纯水机Ultrapure-KELOW微电脑自动高压消毒锅MLS-3750日本三洋2.1.4试剂配制