酵母单杂交技术Yeast One-hybrid method）一、原理酵母单杂交方法是根据DNA结合蛋白（即转录因子）与DNA顺式作用元件结合调控 报道基因表达的原理来克隆编码目的转录因子的基因（cDNA）。该方法也是在细胞内（in vivo）分析鉴定转录因子与顺式作用元件结合的有效方法。将已知的特定顺式作用元件构建 到最基本启动子（minimal promoter，Pmin）上游,Pmin启动子下游连接报道基因。进行c DNA 融合表达文库筛选时，编码目的转录因子的c DNA融合表达载体被转化进入酵母细胞后， 其编码产物（转录因子）与顺式作用元件结合，就可以激活Pmin启动子，并促使报道基因 表达。根据报道基因的表达，筛选出与已知顺式元件结合的转录因子。二、实验步骤 构建报道子载体：将已知的特定顺式作用元件按同一方向随机串联到一个最小启动子 （minimal promoter， Pmin） 上游，其下游连有报道基因； 将构建好的报道子载体转化酵母细胞筛选合适的3-AT浓度； 提取总RNA,合成c DNA双链； 将报道子、c DNA和融合表达载体共转化到酵母中，在相应的缺陷性SD培养基上进行筛 选阳性克隆； 对阳性克隆进行鉴定，去除假阳性克隆； 对所获得的阳性克隆进行测序，为进一步分析打下基础。如可进一步分析DNA确切的结 合位点。三、图片分析1、选择YM4271 pHISi3NF4克隆株重复进行3-AT梯度试验，在没有3-AT的SD/-His平 板上生长状态很好，在15mM 3-AT存在下被明显抑制，而在30mM 3-AT存在下完全不能生 长。故选择15mM为筛库实验的3-AT工作浓度。2、经9天培养，在SD/-Leu/-His/ +15mM3-AT选择培养基上共长出351个大小不同的阳性 候选克隆。取100个菌落划线于30mM 3-AT和60mM3-AT平板，仅有1个克隆被淘汰。证实15mM3-AT啲选择是正确的。挑取阳性候选克隆菌落提取酵母质粒并转化E .coli Top 10F后，酶切鉴定，共得到31个初筛阳性克隆。四、严谨性分析1、为了克服His3基因的渗漏表达对筛库实验结果的影响，我们选择克隆株重复进行3-AT 梯度试验。菌株在没有3-AT的SD/-His平板上生长状态很好，在15mM 3-AT下被明显抑制,而在30mM 3-AT下完全不能生长。故选择15mM为筛库实验的3-AT工作浓度。2、存在假阴性结果。Pull-downs 的原理、步骤、图片分析、实验严谨性原理：用固相化的、已标记的诱饵蛋白或标签蛋白（GST-、PolyHis-或生物素-），借助 蛋白质之间的亲和性，如酶与底物（谷胱甘肽与谷胱甘肽转移酶）或抗原与抗体（Myc蛋白 与其抗体） 、细菌受体与血清蛋白、多聚组氨酸与金属离子等的亲和性， 从细胞裂解液中 钓出与之相互作用的蛋白。用以确定已知的蛋白与钓出蛋白或已纯化的相关蛋白间的相互作 用关系，从体外或翻译体系中检测出蛋白相互作用关系。步骤：Stepl :从裂解液中固定化融合标记的“诱饵蛋白”Step2 :洗脱未结合蛋白Step3 :结合“猎物蛋白”到固定化的“诱饵蛋白”Step4 :洗脱未结合蛋白Step5:洗脱蛋白质-蛋白质混合物Step6：通过SDS-PAGE或Western分析蛋白与蛋白的相互作用图片分析:active Daamlto 怙 1 Daaml?-=+VJ2.JSO图5 GST pulldown技术捡测HEK293T细胞中Daanil的活性图5是利用GST-Pull down技术检测HEK293T细胞中Daaml的活性，GST-RhoA融合蛋白起 到“诱饵蛋白”的作用，“诱饵蛋白”能结合到带有谷胱甘肽的琼脂糖球珠上，带有活性 Daam1的细胞裂解液经过琼脂糖球珠时会和GST-RhoA结合，进而挂在琼脂糖球珠上，经过 洗脱去除其它杂蛋白，再经过高强度的洗脱把GST-RhoA+Daam1洗脱下来进行Western鉴定 活性Daam1的存在。第一行代表有活性的Daam1 ；第二行代表总的Daam1； GST列无条带 表示:GST并不能与Daam1结合，从而排出假阳性的可能性oGST-RhoA融合蛋白可以与Daam1 结合，Western显示出条带，证实了 Daam与GST相互作用。加入GTP y S是为了活化RhoA， 从而使其结合更多的Daam1进而提高整个系统的灵敏性和准确性。实验严谨性分析：?M+VWS,JS!3r-soactive Daamltotal Daartii图5 GST pulldown技术检测HEK293T细胞中Daanil的活性如果无 GST 条带，实验缺乏对照，如果 Daam1 也于 GST 结合，会对实验结果造成假阳性 的结果。如果无 total Daam1 条带缺乏内参对照。备注：（文献中其他图）M2314RJioA200 bp800 bp500 bpM：DNA标准“：空白对!S；2：假阳性克隆；3冲：阳性克隆口图1重组原核表达载体阳性克隆的PCR鉴定图1对于构建的表达载体插入的目的基因进行RCR鉴定，表明目的基因片段的存在。&GCIGCCAT 亡匸卜一划线分别表示起始密码子（丸）相终上密码子爲图2堇组原核表达裁体阳性克隆的部分测序结果JJ如7t J. A T C I -S fiG TC CT TGTCTTGT G A J G A A T T C C C图 2 是对于编码 RhoA 的目的基因序列进行测序进而证实该基因正确的存在。仏蛋白标准：h空白BL21菌株；2文未经1PFG诱导组；3：lRrG 诱导组口图3 GST-RhoA重组蛋白在I3L21中的表达图3为GST-RhoA融合蛋白在大肠杆菌中的表达，通过考马斯亮蓝染色证实重组质粒在大肠 杆菌中成功表达。其中IPTG起到诱导RhoA蛋白表达的作用。12347 kD _GST RIioA32 kDh空白BL21菌株：厶未经1PTG诱导组；3JPTG诱导组口图4 GST-RhoA重组蛋白的检测图4是对于重组蛋白GST-RhoA进行Western特异性检测，证实GST-RhoA在大肠杆菌中特异 性、高水平表达。表达载体构建1. 获取目的基因从genebank中查询到海参溶菌酶基因（EF036468）原始序列，其247-684位是该序列的 保守开放性阅读框（ORF）如下图：ORIGIN1 atgatgttgc cattagaaac aagacacatt aggtgttata tatcttttag acaatgtacc61 tttgaatgat tatttttaag ggggcgcagt cgccacgtaa gctggatggt ttcagatatt121 tcctgagacg cacaatacat ttctctgacg tcaagattcg tgacgtcact cagcaatttt181 tgacgaacat ctgcgacagt ataagtgaac gatcattaaa catagttgta gcagatcgcg241 ccgacc 辿吐辺型世301361 ataccttccc cattgtgtca tatggatgta ggatcactgt catgtggtcc ttaccaaatc421 aaactaggcctggcagggctaggctagggaggttctggatggattggcag 481 aaatqttcaaacctttqtqcaqtqaqqgctqtaqqqttataqcacqqtac 541601 jjcjgaccatcttcaaatccajcctgaaaaattjttgagtgaagaaa661 tjtcttgacgajcaacatgaacaaac ctcaacttaa taaaaaaaaa aaa2. 引物设计上游引物可从保守序列，即第247位开始选取连续的15-20个碱基，下游引物则从684 位反向选取碱基（注意应为3 的倍数，以避免移码导致阅读框的改变），估算两个引物 的GC含量及Tm。Tm可按以下公式估算：Tm=4 （G+C） +2 （A+T）。一般Tm以55-80 摄氏度之间为宜， GC 含量在 40%-60%之间。引物的 5 端可以进行修饰，而 3 端不可修 饰，这是因为DNA的合成是从5端向3端进行的。因此引物的3端碱基序列应尽量与 模板互补配对，尤其是最后的5 到 6 个核苷酸序列。此外，由于天然的原核表达载体上 只有一个启动序列，为保证目的基因后的报告基因能正常表达，故引物的3端必须去除 终止密码子，避免重组载体的蛋白表达停止。 5 端可根据需要选择合适的酶切位点进行 修饰编辑（目的基因应不含有该酶切位点）。为了确保其酶切的特异性，可加入保护碱 基，但要注意引物的长度不能过大，而使退火温度过高。保护碱基的添加有专门的保护 碱基对应表，可根据不同的酶切位点选择合适的保护碱基。其他注意事项包括避免出现 大量重复碱基、3端最后5个碱基不能出现多于2个G或C、避免出现同源二聚体、错 配等等，引物设计完之后可进行Blast比对。无误后引物合成。3. PCR 扩增目的基因4. 琼脂糖凝胶电泳 跑出条带后胶回收。5. 提取质粒6. 对质粒和目的基因进行酶切和连接注意将目的基因连接在启动子/启动序列之后7. 鉴定一般包括：重组质粒的测序、双酶切的鉴定等。酶活测定分光光度法1G-6-PDH2、3、4、葡萄糖+ATP 葡萄糖6-磷酸葡萄糖6 磷酸+ NADP+邻苯二胺(OPD)半乳糖苷黄色)碱性磷酸酶对硝基苯磷酸酯注意事项：一、合适的底物，辅因子、活化剂、变构剂的种类和浓度1、底物：对待测酶有较高的特异性；Km值小，以使Vmax时的底物浓度低，降低试剂 成本，防止出现底物难溶现象；底物浓度合适，多数酶Km在10-310-5 mol/L，底 物浓度最好为Km的20100倍，一般不可低于10倍2、辅因子、活化剂的种类和浓度：如辅酶、辅基、离子以及其他加速酶反应的物质3、变构剂的种类和浓度：边沟没的反应速度和底物浓度呈S形曲线，变构剂分为变构 激活剂和变构抑制剂，影响变构酶和底物的作用速度，不同浓度的变构剂改变曲线 的形状，测变构酶活性浓度时，一般在饱和浓度的变构剂的条件下进行二、选择酶最适反应系统1、缓冲体系的pH：最适pH时，V最大2、离子种类和强度3、温度4、其他影响酶活的因素：氧化剂，氧化酶蛋白中的甲硫氨酸、络氨酸、色氨酸残基使 酶失活）；表面活性剂（Tween-80、Brig-35），抑制酶活；抑制剂三、确定反应时间 选用产物生成与反应时间呈线性关系范围内的时间点为测定选用的时间四、酶液稀释度对酶活测定的影响 稀释可能降低酶的稳定性，降低样品中原有抑制因素和辅因素的浓度，而且许多酶活力 和稀释倍数成正比。酶分子与底物分子的数量比列中有在适当的范围内时酶的活力与产 物生成才成线性正比例关系。稀释倍数过大影响酶的稳定性， A 值过小结果偏低；稀释 度低，吸光度太大，使结果大大偏低。应使吸光值在 0.2-0.5 之间可得相对稳定的测定 结果。五、标准曲线 制作时尽可能和样品在同一条件下反应，以减少系统误差。吸光值和产物应为线性关系 范围，酶样测定值在线性范围内。六、显色剂的配制对酶活测定的影响 显色剂的类型，其中各物质的配比