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第一章基因、复制子及基因组第1节基因概念的发展经典遗传学关于基因概念的要点: 基因是不连续的颗粒状因子,在染色体上有固定的位置,呈直线排列,具有相对稳定性。 基因作为功能单位控制有机体的性状表达。 基因以整体进行突变,是突变的最小单位。 基因是重组的最小单位,在交换中不再分割。 基因能自我复制,在有机体内通过有丝分裂有规律地传递基因的cistron和operon概念什么是cistron?在反式构型中,不能发生互补的各个突变型在染色体上所占的一个区域称为一个顺反子。cistron既有功能上的完整性,又有结构上的可分性。操纵子(operon)概念:操纵子(operon):指包含结构基因、操纵基因以及调节基因的一些相邻基因组成的DNA片段,其中结构基因的表达受到操纵基因的调控。蛋白质呈反式作用,DNA位点呈顺式作用起调节作用的DNA 序列称为顺式作用元件。所有基因产物,RNA或蛋白质,都是反式作用因子,可作用细胞内基因的任一拷贝。在“基因”这一术语中,位于同一条DNA上的位点称为顺式(cis),位于2个不同DNA分子上的位点称为反式(trans)。互补试验认为,当2个突变以反式存在时,如果其功能不能相互补偿,则这2个突变位于同一基因内。即同一基因内的突变不能互补。“顺反子”,“互补群”,“基因”都用来描述一段DNA,顺反子是互补试验定义基因的遗传单位。互补群是指互补试验中,不能相互补偿的一系列突变。如果一个位点起反式作用,它肯定是通过产生可扩散的分子而起作用,这种分子通常是蛋白质,可作用于细胞内的多个靶点。如果一个突变是顺式的,它肯定是以DNA位点形式而不是以蛋白质或RNA形式起作用。什么是基因?基因是一段核苷酸序列(DNA or RNA)指导合成一种功能性肽链或RNA分子,包括外显子、内含子等全部序列是遗传物质最小的功能单位第2节 基因组概述基因组(genome):指生物体活细胞中一套单倍体遗传物质的总合。C值(C-value):指单倍体基因组的DNA总量。是生物的重要特征。如何知道某一基因是否是必需的?答案是:通过突变分析来确定。如:插入突变法。mRNA丰度( mRNA abundance ):指每一细胞中,每一种mRNA 的平均数量。如何测定表达基因的数量:RT-PCR;realtimePCR;microarray;SAGE第3节基因组结构基因组概念,还包括真核微生物不同DNA分子上的结构分布和排列情况。Virus genome 的核酸有正负链之分。正链RNA病毒:病毒的ssRNA可以直接作为mRNA,指令合成外壳及核酸,并组装成病毒体。负链RNA病毒:病毒的RNA不能直接作为mRNA。因此,其RNA分子无感染性,需要转录出mRNA才有感染性,但这种转录需要病毒自身的 RNA polymerase ,寄主细胞是不具备的。所以,负链RNA病毒都是以完整的病毒颗粒作为感染单位,才能在寄主内正常的复制及繁殖。重叠基因的定义:不同的基因共用一段DNA序列,按照不同的阅读框转录,编码一条以上的多肽链。 思考题:1、重叠基因图是通过什么方法做出来的?2、一条双链DNA片断理论上可以编码多少种氨基酸序列?端粒(Telomere):线形的染色体末端DNA重复序列与蛋白结合的复合体结构。扩增:染色体某些区段的DNA序列,其拷贝数专一性地大量增加的现象。AUD和ADS:(1)扩增单位,AUD(amplified unit of DNA)指 DNA扩增的区域。AUD长度通常525kb,两端是12kb的重复序列。(2)扩增序列,ADS (amplified DNA sequence)指实际扩增的DNA 序列。ADS是由多个AUD串联而成,可从几个到几百个。真核基因的着丝粒、端粒和复制起点:着丝粒:着丝粒是DNA上的一段特殊结构,在细胞分裂时提供纺锤丝结合位点。有点着丝粒和区域着丝粒端粒是真核生物(和某些原核生物)线性染色体两端的特殊DNA与蛋白质的复合体结构。ARS:酵母的复制起点是指染色体上控制DNA复制起始的一小段 DNA 序列,通常称为 自主复制序列(ARS)。分为A、B、C三个结构域,A、B 2个结构域最重要。结构域A由11个核苷酸组成了保守序列,称为ARS共有序列( ARS consensus sequence),简称ACS。ORC:6种蛋白以复合体形式存在,称为起始识别复合物,简称ORC (origin recognition complex)。ORC与ARS共有序列ACS结合。 ORC特性类似原核生物DNA复制起始蛋白。第4节 复制子与细胞周期细胞周期与复制的2个普通的准则: DNA复制的启动,保证了细胞的进一步分裂; 复制的结束触发了细胞分裂。复制子(replicon):DNA中发生一次复制的单位称为replicon。噬菌体或病毒DNA也包括一个复制子,但它们在一个感染周期中能引发多次复制。 对于这些原核生物中的特例,定义应该为:含有一个复制起始位点,并且能在细胞中自组复制的DNA分子。一个细菌复制子需要具有以下几种功能: 启动复制过程; 控制启动的频率; 将已复制的染色体,分配到子细胞中去真核与原核生物复制的一个明显区别:真核生物染色体在完全复制好之前,不会再启动新一轮的复制。而原核生物在快速生长时,起点可以连续发动复制。真核生物在快速生长时,往往采用更多的复制起始点。A蛋白:噬菌体基因组利用滚环式复制,A蛋白是一种松弛酶(relaxase):具有切割双链DNA能力,并与同时释放出的5端相结合。A蛋白,是顺式作用蛋白,只同该基因组DNA相结合。但在体外,A蛋白对任何DNA模板都有活性。每个细菌在复制与细胞生长之间有两个联系:A. 复制周期启动的频率与细胞生长速度相适应B. 复制的完成与细胞分裂相关联复制周期可以根据以下两个常量来定义:(1)C复制整个细胞染色体所需的固定时间约40分钟。(2)D一个复制周期完成时和细胞分裂之间的固定时间约20分钟。细胞如何知道什么时间启动复制?当细胞质量与染色体起始点数目达到一个固定比率时,细胞则启动复制。细胞质量如何确定?在整个复制周期中会持续合成启动蛋白质(initiator)该蛋白积累到一定量时就会引发启动。另一种可能是抑制物的负控制,在固定时间内会合成抑制物蛋白质,随着细胞体积增大,抑制物被稀释到低于效应水平,从而引发复制的启动。周隔环面是细菌包膜发生变化而形成的包住细胞的环状结构。第二章 基因突变和DNA损伤修复第2节、DNA损伤DNA损伤指:生物在生命过程中,其遗传物质DNA发生的任何改变。包括2类:1、碱基的改变:通过序列的变化改变子代的遗传信息;2、DNA双螺旋结构的异常:会对复制、转录过程产生生理性伤害。自发性损伤:(1)DNA分子的内部运动:碱基的脱氨作用,引起碱基置换。如GC-AU; (2)DNA环出效应;(3)自发突变有热点:热点主要原因:来自修饰过的碱基5-甲基胞嘧啶,它能够自发脱氨基成为胸腺嘧啶(T)。糖基水解酶切除错配碱基过程:1.翻转 2.切除 3.去除磷酸二酯键骨架 4.填补其参与的过程还有:1.切除被烷基化的碱基 2.光复活酶解聚二聚体 3.甲基化酶修饰碱基对短时间的高温处理诱发DNA损伤作用机理:专一性作用于GC碱基对,引起转换或颠换:1.使C脱氨基,变为U。使GC-AT;2.使G碱基上的脱氧核糖键移动,进而引起碱基对颠换。化学因素诱发的DNA损伤:(1) 碱基类似物的参入:碱基类似物比正常的碱基更易出现互变异构,引起DNA的配对错误。(5-BU,T碱基的类似物,烯醇式-酮式):若5-BU以酮式分子参入DNA,形成A-BU碱基对,称为复制错误。复制错误突变细胞数将随分离次数增加,表现遗传不稳定性。DNA复制时参入5-BU形成G-BU碱基对,称为参入错误,参入的5-BU为烯醇式。(2) 亚硝酸:使碱基氧化脱氨基(3) 羟胺:羟胺只作用C,诱发G-C至A-T的单向转换(4) 烷化剂:拟辐射诱变剂第3节 DNA损伤修复增变基因mut 系统参与的损伤修复:1、 Mut 系统识别和修复被氧化的碱基及其错误配对碱基 甲基化引导的错配修复系统:MutH、S、L: 该修复系统的特点:特异性不强。能够修复DNA双链结构的任何轻微损伤。包括错配、移码、碱基类似物的替代等等。修复合成的DNA新链,由聚合酶完成Mut二聚体结合到错配碱基处。MutH二聚体和Mut加入。核酸内切酶MutH在尚未甲基化的DNA子链切开一个切口。Mut含有个结合位点,第一个位点是特异性的错配碱基。第二个位点是非特异的。可以沿DNA链移动位置,直至遇到GATC序列为止。Mut移位时从A-C处至GATC处的DNA形成环状结构。降解DNA子链。由多种核酸外切酶,可沿35,也可沿53方向切除至A-C处,由解旋酶uvrD辅助。重新合成子链。MutT、M、Y对碱基氧化的修复:甲基化:负责为DNA甲基化的酶是由dam基因编码的甲基化酶Dam(Dam methylase),其靶序列就是GATC/CTAG,在A 的N6 位置甲基化。Dam酶非常重要,作用:调控DNA的复制,作用引导正确的损伤修复。错配修复思考题1、若菌株基因型为 dam-(甲基化酶基因突变),该菌株能否进行错配修复?2、实验设计利用分子生物学方法证明:只有半甲基化的DNA才能进行错配修复?E. coli 中的重组修复系统E. coli 的rec基因编码主要的重组修复系统的酶。复制在新合成链中留下一个对应于损伤序列的缺口时,此系统启动。SOS系统:DNA损伤导致RecA激活SOS负控蛋白LexA(与SOS BOX结合)的自动切割活性,引发SOS应答途径,这条途径由许多编码修复酶的基因组成。SOS修复:也称为倾向差错的修复(Error prone repair ),是在DNA分子受到较大范围的损伤或是DNA复制受到抑制的过程中,经诱导产生的一种修复作用。SOS修复开始后,允许新合成的DNA链越过 dimer,而不间断DNA的链延伸。其代价是DNA复制的忠实性和保真度极大降低。应答细胞的表型是,增强了损伤DNA的修复能力,细胞分裂受阻,诱导溶源phage的释放。Rec蛋白活性:1)直接参与重组修复;2)蛋白酶功能,激活的RecA导致LexA发生自动切割,进而他所结合的所有操纵子(包括RecA和LexA),都被诱导。其两种活性独立。SOS通路起始于受损伤的DNA激活了细胞中适量表达的RecA,使其具有了蛋白酶的活性,进而消除LexA的阻遏,使参与修复的基因都大量表达,细胞则快速地修复损伤的遗传物质。当细胞DNA被修复,激活RecA的信号自然消失,RecA蛋白失去了使Lex蛋白不稳定的能力,lex基因大量表达。umuC 和 umuD: 这2个基因编码的蛋白可帮助细胞耐受DNA损伤,使DNA聚合酶能越过损伤部位而继续复制,在此过程中引起突变。因此,SOS修复中导致突变的关键蛋白是UmuC和UmuD。umuC、D 2个基因组成一个转录单位,共用一个启动子。在正常细胞中,像其他SOS基因一样,也被LexA蛋白阻遏。现行的假设模型是:UmuD、C形成复合体。复合体被RecA蛋白激活,D切割成D。该复合体被激活,结合到DNA聚合酶上,代替了原来酶上的亚基,允许DNA聚合酶快速“通读”损伤的DNA模板,聚合酶的校正功能被修饰丧失,碱基配对出现
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