动物性蛋白质饲料胃蛋白酶消化率的测定 过滤法参考标准：GB/T 17811 -2008、适用范围适用样品名称不适用样品名称原料斗1动物性蛋白质原料植物性蛋白质原料成品动物性蛋白质饲料植物性蛋白质或混合饲料二、实验原理已脱过脂的试样，用温热的胃蛋白酶溶液（酶液浓度和用量与酶解试样质量恒定 ）,在 恒 温、持续不断地振摇或搅拌下消化 16小时,过滤分离不溶性残渣，洗涤、干燥,测定残渣 的粗蛋 白质含量。同时测定空白和脱脂未酶解试样的粗蛋白质含量。二、实验用品1 实验用试剂试剂名称规格/浓度配制方法备注乙醚AR无需配制在空气中会慢慢氧化 成过氧化物，过氧化 物不稳定，加热易爆 炸，应避光保存。内酮AR无需配制易燃、易挥发。胃蛋白酶溶液胃蛋白酶活性1： 1000020 IU/ml将61ml浓盐酸稀释至 1000ml水中（溶液PHl2）,水浴加热至42C 45C，加入2g （精确至土0.0002g ）活性为 1:10 000生化级胃蛋白 酶，并缓慢搅拌直至溶 解。（1）此溶液临用前 配制。（2）勿在加热板上 加热胃蛋白酶 溶液或配制时 过热。浓硫酸AR 98%无需配制，直接使用具强腐蚀性、强刺激 性，可致人体灼伤。混合催化剂AR称取 0.4g CuSO42 5HO,6g&SQ,磨碎混匀氢氧化钠AR 40%水溶液称取40g氢氧化钠用去 离子水配成100ml溶液。此溶液置于塑料桶中 保存。硼酸AR 2%水溶液称取2g硼酸固体，加热溶于水，配成100ml溶 液。混合指示剂称取0ig甲基红溶于95%乙醇，配成100ml溶 液；称取05g溴甲酚绿溶于95%乙醇，配成100ml溶 液；两溶液等体积混合。阴凉处保存有效期二 个月硫酸铵AR无需配制使用刖在105C干燥箱中干燥至恒重蔗糖AR无需配制糖类物质，不能在 105 C干燥箱中干 燥，使用时可不干 燥。盐酸标准溶液AR具体见附录22. 实验用设备仪器设备名称规格高速万能粉碎机FW80分析筛孔径084mm （20目）分析天平感量 0.0001g冷冻水浴恒温振荡器LSHZ-300FOSS手动索氏提取系统2055消煮炉可控温420C凯式烧瓶250ml凯氏蒸馏装置常量直接蒸馏式磨三角瓶带盖，250 ml布氏漏斗 80mm真空泵XZ-1快速定量滤纸 12.5cm容量瓶1L烧杯100 ml, 1L滴定管白色、酸式，25ml锥形瓶250m1序号实验项目操作内容注意事项1样品制备选取有代表性的样品用四分法缩减至 200g,粉碎后全部通过20目筛，置于 密闭样品袋中，阴凉处保存，备用。试样勿吸潮变质。2样品脱脂称取4g试样于滤纸筒中，用FOSS手 动索式提取系统按粗脂肪检测方法进 行，脱脂后的样品只需在室温风干， 去掉石油醚即可。含脂肪小于19可不脱脂；含脂肪 1% 10%建议脱脂；含脂肪大于 10%则应脱脂。3胃蛋白酶 消化称取已脱脂风干后的试样1.0000g(精确至土 0.010g)于 250 ml干燥的带盖磨瓶中，加150 ml新配 制的并已预热至42C 45C的胃蛋白酶 溶液盖紧瓶盖，将瓶夹于恒温摇床上，于45C、80 r/min恒定速度搅动16小时进行保温酶解消化。(1) 应确保磨瓶中样品完全 被胃蛋白酶溶液浸湿。(2) 同时做酶液空白测定(即不 加试样，其它步骤一样)4消化残渣的处理从搅动器上取下磨瓶，呈45 角放 置，让残渣沉淀15min以上，随 后在 铺有滤纸的布氏漏斗上抽滤，先用少 量水将瓶盖上的残渣洗至滤纸，再将 磨瓶保持沉淀时的角度移至布氏漏 斗上，慢慢倾出内容物，使之通过滤 纸后形成连续的细流，避免任何不必 要的搅动。(1) 先过上层清液，液体通过 滤纸的速度应与倾入的速 度相同。(2) 过滤过程要小心操作，保 证残渣毫无损失。当上层液体通过滤纸后，于瓶中加入 15m 1丙酮，用拇指盖住瓶剧烈振 摇，放开。再用拇指堵住瓶口，在滤 纸上方将瓶倒置振摇，放开拇指，丙 酮和残渣流到滤纸上。再用磨瓶内的残渣要全部冲洗至滤 纸上。玻璃棒玻璃棒三、实验内容份15ml的丙酮进行洗涤，照上法 振摇和倒出。检杳瓶子，并用丙酮 再 次洗涤。当全部液体通过滤纸后，用 洗瓶以少量丙酮洗涤漏斗壁上残 渣两 次,并抽干。从布氏漏斗上小心取下载 有残渣的滤纸（用滤纸将残渣包裹 好），无损地移入100烧杯中并置于 105C烘箱内烘干。5粗蛋白质 的测定将上述已烘干的滤纸包无损地移入凯 氏烧瓶中，按FOSS定氮仪测定饲 料中粗蛋白含量的方法测定残渣粗 蛋白质的质量分数（J。同时，称 取脱脂风干的样品0.3 g（精确至 0.0002 g），直接按FOSS定氮仪测定饲料中粗蛋白含量的方法 测定脱脂未酶解的样品中粗蛋白质的 质量分数（31）。测定残渣粗蛋白质时应从每个样 品残渣粗蛋白质中减去酶液的空 白值。6计算出_ 3 *X =X1D03 !X-试样胃蛋白酶消化率，以质量 分数计（ ;3脱脂未酶解的样品中粗蛋白质 的质量分数（ ;3 -脱脂酶解后的残渣中粗蛋白质3 2的质量分数（。重复性：1 每个试样脱脂风干后取两份试料进行酶解，平行测定残渣粗蛋白质的质量分 数，以其算术平均值为测定结果（保留三位有效数字），测定结果的相对 W6%2 每个试样脱脂风干后取两份试料进行平行测定粗蛋白质的质量分数，以其算 术平均值为测定结果（保留三位有效数字），测定结果的相对偏差应符合：粗蛋质含量允许相对偏差25%1%10%冶 25%2% 10%3%3 每个试样胃蛋白酶消化率测定结果保留三位有效数字误差来源及分析误差来源控制方案样品抽样取样要有代表性、真实性。制备样品要有一定数量；充分混匀，用四分法缩分；粉碎至能全 部通过20目。试剂试剂规格按照标准要求选购一定规格的试剂，控制杂质量。配制方法区分精确配制和粗配制。加热方式胃蛋白酶溶液配制时用水浴加热，防过热。保存按照试剂的保存要求（避光、塑料瓶、阴凉等条件限制）存 放。注意试剂的保存期限。称样称样量称样量要适宜，一般根据该样品的含氮量和所适用的滴定管最 大体积估算，保证滴定体积不低于滴定管量程的1/3,不超过其量程。消化条件于45C恒定速度搅动16小时。过滤操作要先过上层清液。要保证残渣毫无损失。滴定操作严格按照标准滴定操作进行。系统气密性用AR硫酸铵蒸馏，根据测得的含氮量评估系统气密性。附录2:盐酸标准溶液的配制与标定参考标准：GB/T601-20021. 盐酸标准溶液的配制按下表的规定量取盐酸，注人1000m L水中，摇匀盐酸标准滴定溶液的浓度c(HCI)/(mol/I)盐酸的体积Vm/L1900.5450.192. 盐酸标准溶液的标定按下表的规定 称取于270-300 C高温炉中灼烧至恒重的工作基准试剂无水碳酸钠，溶于50ml水中，加10滴溴甲酚绿-甲基红指示液，用配制好的盐酸溶液滴定至溶液由绿色变为暗 红色，煮沸2 min，冷却后继续滴定至溶液再呈暗红色。同时做空白试验。C(HCI)=m 1000(V1-V2) Mm-无水碳酸钠的质量的准确数值,单位为克(g);盐酸标准滴定溶液的浓度C(HCl)/(mol/L)工作基准试剂无水碳酸钠的质量。m/g11.90.50950.10.23计算盐酸标准滴定溶液的浓度c(HCI) 数值以摩尔每升(mol/L表示，按式 计算:V1 -盐酸溶液的体积的数值，单位为毫升(ml);V:-空白试验盐酸溶液的体积的数值，单位为毫升(mL)M-无水碳酸钠的摩尔质量的数值，单位为克每摩尔(g/mol)注意事项：1.灼烧温度不能超过300度,当温度超过300度时无水碳酸钠分解，可将马福炉的温度调至 250,等升温稳定后再调至280,或者将马福炉事先升温至280度，待稳定后再放入无水碳 酸钠2. 无水碳酸钠的称量质量小于 0.2g 时要用十万分子之一天平称量。3. 混合指示剂为 0.1%甲基红， 0.1%溴甲酚绿， 1：1 混合。4. 滴定一定要滴到暗红色再煮沸，可事先根据大体浓度计算大约的滴定体积5. 滴定终点到达之后一定是再次去煮不会变回绿色。