随机扩增多态性DNA标记技术参考周延清2005.生物实验室系列-DNA分子标记技术在植物研究中的应用. 北京化学工业出版社 P79-130一、引言随机扩增多态性 DNA 标记技术,检测出核酸碱基序列的变异，并且将这种变 异以遗传标记的方式予以应用，使植物遗传学许多方面的研究产生了革命性的变 化。最早检测到的DNA水平的变化是限制性片段长度多态性(RFLP)。但是， 在过去一段时间，聚合酶链反应(Pol ymerase chain reaction, PCR )极大的影响了 分子生物学几乎所有领域，而且基本程序被改进后，可以开发出多种检测核苷酸 水平差异的方法。不过，这些方法大多需要预先知道DNA片段序列的一些信息， 以便根据已知的信息设计合成目的的DNA序列两端的引物，通过PCR选择性地 扩增目的的DNA。1990 年, Williams等发表了一种检测核苷酸序列多态性的新 方法，这种方法以PCR为基础，可不必预先知道DNA序列的信息。随后，随机 扩增多态性 DNA 技术( randomly amplified polymorphic DNA,RAPD )广泛地应 用于植物和其它领域的研究中。RAPD标记技术由于操作简便、快速、省时、省力、DNA用量少，迅速受 到人们重视，并在农、林、医及植物和微生物学的各个领域中得到广泛应用，在 基因定位与分离、连锁和系统演化等各方面取得了很大的进展。二、RAPD 标记技术的概念和原理任何生物种都具有特定顺序和结构的遗传物质DNA。由于在生物进化过程中选择性的不同。生物基因组DNA的不同区域表现出高度保守或高度变异的 现象，具有不同的遗传多样性。随机扩增多态性DNA(RAPD)标记技术是通过 分析遗传物质DNA经过PCR扩增的多态性来诊断生物体内在基因排布与外在性 状表现的规律的技术，由于片段被引物选择性地扩增，扩增了的片段能在凝胶上 清晰地显现出来，这样就可以通过同种引物扩 条带的多态性反映出模板的多态 性， RAPD 只需要一个引物，长度为 10个核苷酸左右，引物顺序是随机的，因 而可以在对被检测对象无任何分子生物学资料的情况下对其基因组进行分析。单 引物扩增是通过一个引物在两条DNA互补链上的随机配对来实现的，但基因组DNA 分子内可能存在或长或短的被间隔开的颠倒重复序列，那么在两条单链上 就各有一个引物结合部位，构成单引物 PCR 扩增的模板分子。如果引物的核苷 酸序列很短，退火温度又很低，引物与 DNA 模板颠倒重复序列的机会就会增多， 产生若干单引物PCR扩增产物，形成该引物的特异图谱。不同DNA中的这种颠 倒重复序列数目及间隔长短的不同，扩增的条带就不同，即出现多态性。当引物 较短时，很多在染色体上相邻且方向相反的引物位点存在于基因组内（图4-1）.，.:,.，引物卷3CACCCCAGAA5* * * * i -5， GTGGCGTC TT37II .-、-.-引物间距f3，TTCTGGGGAG宀5，AAGACCCCTC3, 二: :7引物.：-.，图4-1用ECR对多态性DNA片段的随机扩增.,：二PCR技术扫描含有这些颠倒重复序列的基因组，而且扩增不同长度的插入DNA片段。实际 上由于PCR扩增技术的限制，长度在200-2200bp的片段能够扩增出，在这范围以外的片段 不能扩增。三、RAPD 标记技术的特点作为PCR技术的延伸，RAPD反应有其自身的特点。这也是RAPD标记技术一诞生就被广泛接受和使用的原因所在。（一） RAPD标记技术的优点 无需专门设计RAPD扩增反应的引物，随机设计的长度为9-10个碱基的 脱氧核糖核苷酸序列均可应用。但是为了保证退火反应时双链的稳定性，G+C 含量应在 40%以上。而常规的 PCR 反应必须通过已知的序列设计 特定的引物，在每一个RAPD反应中只加入一个引物。通常一种引物在 两条DNA互补链上的随机配对实现扩增。 PCR引物没有种属限制，一套RAPD引物可以应用于任意一种生物的研 究，具有广泛和通用性的特点。 在最初的反应周期中，退火温度较低，一般为36C。一方面保证短核链 引物与模板的稳定配对，另一方面允许适当的错误配对，从而扩大引物 在基因组DNA中配对的随机性，提高对基因组DNA进行多态性分析的效率。 不需 DNA 探 针，设计引物也无需预先知道序列信息。 显性遗传（极少数为共显性遗传），不能鉴别杂合子和纯合子。 操作技术简便，不涉及分子杂交和放射性自显影技术。省工、省力，工 作效率高。 DNA 样品需要量少，引物价格便宜，成本低。 不受环境、发育、数量性状遗传的影响，能够客观地提示供试材料之间 DNA 的差异，因而成为一种理想和有效的分子生物学的技术。 RAPD 产物经克隆和序列分析后，可作为 RFLP 和原位杂交的探针，也能 够转变成为利用经典PCR技术的分子标记，诸如序列标记位点（STS）、 序列特征化扩增区域（SCAR）等。（二） RAPD 标记技术的缺点 发生一次或几次突变时引物就不能和引物位点匹配的假设未必成立，不 匹配可能只发生在二次突变或者多次突变的时候。 该技术用于二倍体材料时，区别纯合子和杂合子的统计分析会有难度。 在某些情况下，实验结果不能重复，结果可靠性较低。然而能否重复也 取决于实验条件，细致工作可以提高重复的可能性。 该技术使用的效果因生物种类而定。在细菌中，因其是单倍体又是无性 繁殖，所以， RAPD 标记技术很有用。四、 RAPD 标记技术操作五、RAPD标记技术转化为SCAR标记技术六、RAPD标记技术的应用（一）遗传图谱的构建（二）系统进化发育与以前的形态分析和同工酶分析相比,RAPD标记技术具有灵敏度、简便、 信息量大和对材料要求不高等优点。因此，该技术为物种分类和系统演化方面的 研究提供了一种可靠、快速的研究手段。作物亲缘关系鉴定与研究能够为杂交亲 本的选配提供依据，能够有效地预测杂种优势，能够确定不同作物品种之间亲缘 关系及其进化地位，有选择的利用其某些优良农艺性状改良作物。所以，作物育 种研究人员目前已经利用 RAPD 标记技术对杨树、水稻、大麦等作物进行了分 类鉴定和系统进化分析。亲子鉴定RAPD标记技术适合种内、种间、甚至近缘 属间亲缘关系研究（三）基因定位RAPD 技术既能对整个基因组进行多态性检测，又能迅速定位某些抗病等重 要性状基因。利用 RAPD 标记技术进行基因定位，根据样品来源不同有如下两 种方法：首先，近等位基因系（near isogenic lines,NILs）的基因定位，所谓NILs 是由提供目标基因的供体亲本同轮回亲本杂交，并多次回交，经每代对目标基因 选择而获得的，除目标基因外其余性状大部分都同轮回亲本相同的品系。因此， 其基因组DNA除目标基因所在区域同轮回亲本不同外，其余部分则基本相同。 这样就可用RAPD标记技术对这两个基因组轮回亲本和近等位基因系DNA进行 多态性检测，找出两个基因组扩增产物的差异，以这些差异产物为标记，经 RFLP 分析即可定位此基因。其次还有Michelmore提出的分离群体分组分析法（bulked segregation analysis,BSA）。（四）植物分子标记辅助选择育种分子标记用于辅助选择育种可提高选择的准确性和效率，缩短育种年限。RAPD标记技术用于辅助选择育种已经取得了很大的进展，定位了许多有价值的 目标性状基因，为简单方便的鉴定和筛选抗病虫基因提供了一种分子水平的新方 法。在辅助选择育种中， RAPD 标记对质量性状进行标记的主要策略是近等基因 系和混合群体分离法，对数量性状基因进行标记主要采用QTL作图法。1抗线虫基因 Rkn-mn1 的 RAPD 标记 该基因主要存在于野生种中（为显性基因），可通过种间杂交渗入栽培种中 Barloy 等通过作图定位了 3 个与该基因连锁的 RAPD 标记，可通过标记辅助选择把 Rkn-mn1 基因引入到栽培种中。2抗病基因的 RAPD 标记3雄性不育性状的 RAPD 标记 4在耐盐碱性状标记方面的应用 植物耐盐碱性状是由多个核基因控制的，而且胞质基因也起着重要作用。寻 找耐盐碱基因紧密连锁的 RAPD 标记。（五）外源染色体（片段）的鉴定与标记（六）遗传多样性、亲缘关系和品种鉴定的研究（七）体细胞杂种的鉴定（八）性别鉴定第二节任意引物FCR标记技术一引言1990年，在Williams等发表随机扩增多态性DNA标记技术的同时,Welsh等 发表任意引物 PCR（arbitary primr PCR,AP-PCR）;1991 年,Caetano-Anolles 等发明 的DNA扩增指纹（DNA amplification fingerprinting,DAF）.这三种技术都用任意引 物随机扩增，彼此相似，只是它们所用引物的长度不同而已。当然这三种技术中 RAPD应用最为广泛。RAPD标记技术使用10个碱基的寡核苷酸片段作单引物 随机扩增基因组DNA； AP-PCR标记技术使用20bp碱基的任意引物或30bp碱 基的任意引物随机扩增基因组DNA； DAF利用5个或者8个碱基的寡核苷酸片 段作单引物随机扩增基因组DNA。它们有相似的地方，也有各自的特殊性。本 节将对AP-PCR标记技术进行介绍。二 AP-PCR 标记技术的概念和原理Welsh等于1990年用20bp碱基的任意引物或30bp碱基的任意引物随机扩增基 因组DNA，发表了任意引物PCR技术。该技术是一项检测DNA片段长度多态 性的快速、经济、有效的技术。选择的任意引物最好为标准的引物，以便于不同实验室之间的比较。推荐使用的标准引物如下： 通用 M13-20 测序引物： TTATGTAAAACGACGGCCAGT M13 逆转录测序引物： GGAAACAGCTATGACCATG T7 测序引物： GTAATACGACTCACTATAG T3 测序引物： GCAATTAACCCTCACTAAAG KpnR 引物： CCAAGTCGACATGGCACRTGTATACATAYGTAAC Alu278 引物： GTAAGACTCTG三 AP-PCR 标记技术的特点1PCR 产物的多态性符合孟德尔定律2同源片段数目与样品之间的亲缘关系成正相关 3方法快速、经济、简便。四 AP-PCR 标记技术的操作步骤 取材(取桑属各代表种，或根据研究目的取材) 基因组 DNA 的提取 PCR反应液lXTaqPCR 缓冲液，1.5mmol/L四种dNTP各200mol/L2.0mol/L引物TaqDNA 聚合酶 2.5U0.8-1.0 gDNA 模板终体积501,混匀后加入50l石蜡油PCR 所用引物有有三个:a. M13 正向引物(5 CGCCAGGGTTTTCCCAGTCA3)b. M13 反向引物(5 AGCGGATAACAATTTCACACAGGA3)c. )Gal-K 引物(5 TACGGTGGCGGAGCGCAGCA3z ) 按下述参数进行2个不严格PCR循环：94C、5min;35C、5min;72C、5min. 按下述参数进行 40 个循环：94C、lmin;50C、lmin;72C、2min. 72C、7min1个循环； 用 3%（质量浓度）的琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，然后进行放射