2.2 动物细胞工程一、教学目标1.简述动物细胞培养的过程、条件及应用。2.简述通过动物体细胞核移植技术克隆动物的过程和应用前景。3.举例说出动物细胞融合与单克隆抗体的原理和应用。二、教学重点和难点1.教学重点（1）动物细胞培养的过程及条件。（2）用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程。（3）单克隆抗体的制备和应用。2.教学难点（1） 用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程。（2） 单克隆抗体的制备过程。三、教学策略有了第一节的基础，学生对本节内容易于理解。因此，本节教学采用讲授、自学、讨论等相结合的教学方法。具体建议如下。在动物细胞培养的教学中，可把这部分内容归纳成三个问题：（1）为什么要进行动物细胞的培养？（2）什么是动物细胞的培养？（3）怎样进行动物细胞的培养？第三个问题是本节课的重点。关于动物细胞的培养过程，教师可参照教材中的动物细胞培养过程示意图进行讲解，讲解中要注意区分原代培养和传代培养这两个概念。对于动物细胞培养的条件，则要从学生已有的内环境的知识出发，启发学生自己动脑思考这个问题，以加深对培养条件的理解。在动物体细胞核移植技术及克隆动物的教学中，可首先让学生列举所知道的克隆动物，调动学生已有的知识。随后可向学生提问：克隆动物的方法与植物组织培养一样吗？然后向学生说明目前动物体细胞克隆是通过核移植技术来实现的，以引入本节课的主题。关于核移植技术发展简史，可让学生在课堂上阅读，本节课的重点和难点是在动物体细胞核移植技术过程，教材中选用了一个非常好的素材以诞生在我国的高产克隆奶牛为例，来说明体细胞核移植的过程。教师应充分利用和挖掘教材内容，带领学生一步步弄清动物体细胞核移植技术的过程。对于体细胞核移植技术的应用前景和存在的问题这部分内容，可结合本节教材“思考与探究”中的有关问题，以及“拓展视野”中的有关克隆羊多利的早衰问题等，让学生讨论。在细胞融合和单克隆抗体的教学中，教师可先启发学生回顾植物体细胞杂交技术的过程，再通过动植物细胞异同点的对比，引导学生大胆推测出动物细胞融合与植物原生质体融合的原理及方法基本相同，以培养学生的知识迁移能力。随后通过教材上的用灭活病毒诱导动物细胞融合过程的示意图，重点讲解为什么灭活的病毒可用来做诱导物，并指出动物细胞的融合也需要把多个两种细胞放在一起，让它们随机融合后，再从中筛选杂交细胞。最后教师要讲明动物细胞融合技术的意义和应用，以便自然过渡到单克隆抗体上来。关于单克隆抗体的教学，教师要利用好教材提供的材料，突出从问题入手的思路，先介绍医疗实践中仅靠细胞培养难以获得大量抗体，然后，一步一步启发学生讨论怎样解决这个问题。要把科学家在研制单克隆抗体过程中，通过大胆的想像，创造性地解决问题的过程作为本节教学的重点和亮点，使学生在获得单克隆抗体知识的同时，受到创新精神的教育。四、答案和提示2.2.1动物细胞培养和核移植技术（一）思考与探究1.幼龄与老龄动物的组织细胞比较，分化程度低的与分化程度高的组织细胞比较，哪一种更易于培养？思考一下，这是什么道理？提示：细胞的衰老与动物机体的衰老有着密切的关系，细胞的增殖能力与供体的年龄有关，幼龄动物细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，老龄动物则相反。所以，一般来说幼年动物的组织细胞比老年动物的组织细胞易于培养。同样，组织细胞的分化程度越低，则增殖能力越强，所以更容易培养。2.动物细胞培养要经过脱分化的过程吗？为什么？提示：脱分化又称去分化，是指分化细胞失去特有的结构和功能变为具有未分化细胞特性的过程。植物的任何一部分，甚至单个细胞都具有长成完整植株的能力。但要发育成完整植株，必须先脱分化，脱分化的细胞具有发育成任何组织的能力，然后进行再分化，形成完整植株。植物细胞培养主要用于农林生产中的作物、苗木育种，快速繁育种苗、培育无病毒植株等，这就要求植物的组织或细胞先进行脱分化。动物细胞的培养有各种用途，一般而言，动物细胞培养不需经过脱分化过程。因高度分化的动物细胞发育潜能变窄，失去了发育成完整个体的能力，所以，动物细胞也就没有类似植物组织或细胞培养时的脱分化过程了。要想使培养的动物细胞定向分化，通常采用定向诱导动物干细胞，使其分化成所需要的组织或器官。3.1997年，美国威斯康星州的一个奶牛场有一头名叫卢辛达（Lucinda）的奶牛，年产奶量为30.8 t，创造了世界奶牛产奶量最高新纪录。目前世界各国高产奶牛场奶牛，年平均产奶量一般为十几吨，而我国奶牛产奶量年平均水平仅为34 t。（1）能利用体细胞核移植技术克隆高产奶牛卢辛达吗？请说明理由。提示：可以用体细胞核移植技术克隆高产奶牛卢辛达。卢辛达的产奶量很高，说明它有高产奶的遗传基础，利用卢辛达的体细胞克隆的奶牛其遗传物质基本上全部来自该奶牛，其克隆牛具有高产的遗传基础，如果精心培育和饲养，有可能在世界范围内推广，克隆牛再与高产的公牛自然繁殖，可得到很多高产的后代，从而加快奶牛改良进程。但同时需注意，该克隆牛不能无限制地推广，其数量不宜过多，尤其是在小范围内不能无限的繁殖，以避免奶牛群出现近亲繁殖而引起种质衰退。（2）如果将克隆高产奶牛卢辛达的任务交给你，你将如何对它进行克隆？提示：首先从卢辛达耳朵（也可用别的组织、器官，耳朵在活体上容易取）上剪取一小块组织，在体外培养获得该组织（如软骨组织）的细胞。从屠宰场取废弃的牛卵巢，抽取卵母细胞体外培养成熟。用显微针去除卵母细胞的核，再将耳细胞注入卵母细胞，用电刺激方法使卵母细胞与体细胞融合，这时供体核就进入了受体卵母细胞，再用电刺激或化学物质激活注入了体细胞核的卵母细胞，使其完成减数分裂和发育过程。核移植胚胎在体外短时间培养后，挑选正常卵裂的胚胎植入经同期发情处理的受体母牛体内。4.体细胞核移植技术在研究和应用上还存在什么问题？请你查阅资料，了解这方面的前沿动态。提示：在研究方面，克隆动物基因组重新编程的机制尚不清楚，克隆技术效率低，克隆动物畸形率高、死亡率高、易出现早衰等问题。这些问题尚在研究中。在应用上，生产克隆动物费用昂贵，距大规模应用还有一定距离。（二）正文中讨论题【讨论1】多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，根据你所学的内环境的知识，思考并讨论以下问题：1.体外培养细胞时需要提供哪些物质？提示：充足的营养供给、适宜的温度、适宜的pH和气体环境。2.体外培养的细胞需要什么样的环境条件？提示：无菌、无毒的环境。【讨论2】1.在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？提示：为使核移植的胚胎或动物的遗传物质全部来自有重要利用价值的动物提供的体细胞，在供体细胞的细胞核移至受体细胞之前，必须将受体细胞的遗传物质去掉或将其破坏。2.用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞，想一想，这是为什么？提示：培养的动物细胞一般当传代至1050代左右时，部分细胞核型可能会发生变化，其细胞遗传物质可能会发生突变，而10代以内的细胞一般能保持正常的二倍体核型。因此，在体细胞核移植中，为了保证供体细胞正常的遗传基础，通常采用传代10代以内的细胞。3.你认为用上述体细胞核移植方法生产的克隆动物，是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？提示：克隆动物绝大部分DNA来自于供体细胞核，但其核外还有少量的DNA，即线粒体中的DNA是来自于受体卵母细胞。所以，用教材中所述的方法克隆的动物不是供核动物完全相同的复制。此外，即便动物的遗传基础完全相同，但动物的一些行为、习性的形成与所处环境有很大关系，核供体动物生活的环境与克隆动物所生活的环境不会完全相同，其形成的行为、习性也不可能和核供体动物完全相同，从这一角度看，克隆动物不会是核供体动物100%的复制。（三）寻根问底胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗？为什么？提示：胰蛋白酶除了可以消化细胞间的蛋白外，长时间的作用也会消化细胞膜蛋白，对细胞有损伤作用，因此必须控制好胰蛋白酶的消化时间。（四）旁栏思考题1.进行动物细胞传代培养时用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是什么成分？用胃蛋白酶行吗？提示：用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是蛋白质。胃蛋白酶作用的适宜pH约为2，当pH大于6时，胃蛋白酶就会失去活性。胰蛋白酶作用的适宜环境pH为7.28.4。多数动物细胞培养的适宜pH为7.27.4，胃蛋白酶在此环境中没有活性，而胰蛋白酶在此环境中活性较高，因此胰蛋白酶适宜用于细胞培养时的消化。2.为什么对动物细胞进行培养时通常要添加血清？提示：血清中含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等，其中蛋白质主要为白蛋白和球蛋白。氨基酸有多种，是细胞合成蛋白质的基本成分，其中有些氨基酸动物细胞本身不能合成（称为必需氨基酸），必须由培养液提供。血清激素有胰岛素、生长激素等及多种生长因子（如表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、类胰岛素生长因子等）；血清还含有多种未知的促细胞生长因子、促贴附因子及其他活性物质，能促进细胞的生长、增殖和贴附。因此，细胞培养时，要保证细胞能够顺利生长和增殖，一般需添加10%20%的血清。2.2.2动物细胞融合与单克隆抗体思考与探究1.植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术有什么不同？提示：植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术基本相同，不同的是植物体细胞融合前需去掉细胞壁，然后再融合；动物细胞融合是两个体细胞直接融合。2.制备单克隆抗体时，为什么要选用B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞？提示：哺乳动物感染抗原后，其体内会形成相应的B淋巴细胞，B淋巴细胞能分泌相应的抗体凝聚或杀死这些抗原。动物在免疫反应的过程中，每一种B淋巴细胞能分泌一种特异性抗体，要想获得大量的特异性抗体，必须使能分泌该单一抗体的B淋巴细胞大量增殖。B淋巴细动物细胞工程教案（人教版选修3）