基因组编辑三大技术：CRISPR、TALEN和ZFN创新技巧摘要：最近出现的新工具让研究人员能够在几乎任何物种中实现精确的修饰，有着核苷酸水平 的精确度，也有着令人难以置信的速度。大部分是在特定的位置引入双链DNA断裂，然后由 细胞进行修复。区别在于如何引入断裂，以及新序列靶定的难易程度。在过去，如果你想在模式生物中进行复杂的基因组修饰，你几乎只能选择小鼠。首先，你要设计一个打靶载体，将其引入小鼠胚胎干细胞，并将这些经过修饰的细胞注射到 小鼠囊胚。接着是孕育、出生、筛选，等待所需的幼崽成长到性成熟，交配和杂交，之后是 更多孕育、更多筛选，一直下去。复杂的项目也许需要一年或更长时间才能完成。它几乎只对小鼠起作用。原因还不是很清楚， 也许小鼠胚胎干细胞有着特别活跃的同源重组系统。大鼠和人类则不是这样。不过好消息是，最近出现的新工具让研究人员能够在几乎任何物种中实现精确的修饰，有着 核苷酸水平的精确度，也有着令人难以置信的速度。大部分是在特定的位置引入双链DNA 断裂，然后由细胞进行修复。区别在于如何引入断裂，以及新序列靶定的难易程度。锌指核酸酶（ZFN）第一个使用定制DNA核酸内切酶的基因组编辑策略就是锌指核酸酶（zinc-finger nucleases，简称ZFN）。锌指蛋白是转录因子；每个指模块识别3-4 个碱基的序列，将这些模块混合搭配，研究人员 或多或少能靶定他们希望的任何序列。Sigma-Aldrich公司将ZFN技术商业化，推出 CompoZr ZFN 试剂平台。ZFN是异源二聚体，其中每个亚基含有一个锌指结构域和一个Fokl核酸内切酶结构域Fokl 结构域必须二聚化才有活性，确保必须存在两个相邻的DNA结合事件才能实现双链断裂， 从而增加了目标特异性。切割事件使得大部分基因组编辑技术得以实现。在双链断裂后，细胞试图修复它。最简单的 方法是非同源末端接合（NHEJ），其中细胞基本上磨平断裂DNA的两端，再将其彼此拉 近，这往往产生移码。另一种方法是同源定向修复（HDR）。细胞试图利用另一条染色体 上对应的DNA序列作为模板来修复断裂。通过提供自己的模板，用户可促使系统在不经意 间插入所需的序列。ZFN技术由Sangamo生物科学公司所拥有，被用来开发治疗产品。不过，对于科研方面的 应用，Sangamo 则授权给了 Sigma-Aldrich。据 Sigma-Aldrich 公司功能基因组学市场部的负责人 Shawn Shafer 介绍，该公司提供定制 和现货的CompoZr ZFN,售价在4000-7000美元。这些酶在出售前都经过验证，但最近， 他们也为那些愿意跳过验证的客户推出了“fast ZFN”选择，以3000美元的价格提供4对定 制的ZFN。Shafer认为，在这4对ZFN中，九成以上至少有一对是成功的。Sigma-Aldrich最近还推出了一套荧光蛋白标记的ZFN，这样用户就能够利用流式细胞仪来 选择真正表达酶的细胞。目的是让下游的筛选更加高效。TALEN尽管锌指核酸酶还不错，但它们制作起来比较贵，也比较繁琐，故研究人员一般都是从Sigma 订购。之后，一种相似但更为灵活的系统出现了。转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）是二聚的转录因子/核酸酶，由33至35个氨基酸 模块构成，其中每个靶定单个核苷酸。通过组装这些模块，研究人员可靶定他们想要的任何 序列。梅约医学中心的Stephen Ekker将以50年代的晶体管和真空管来比喻TALEN和ZFN。通 过真空管，你可以在原理上设计，但它非常困难；而晶体管让事情变得更容易。同样地， ZFN提供了基因组编辑技术的理论基础，但TALEN做了 ZFN的大部分工作，且更便宜、 更快、更好。 ”与ZFN相比，TALEN还真是便宜。Addgene机构以65美元的价格出售单个TALEN质粒， 而完整的试剂盒只需几百美元。大受欢迎的 Golden Gate TALEN 2.0 试剂盒（来自 Dan Voytas实验室）的也仅售425美元。Dan Voytas是明尼苏达大学基因组工程中心的教授和主任，他也是Cellectis Pla ntBiosciences公司的科学顾问，这家公司开发农业用途的TALEN。Voytas开发优化植物中 基因组编辑的策略。他的实验室使用ZFN、TALEN以及新发现的CRISPR/Cas系统。Voytas谈道，目前他偏爱TALEN，因为他的团队最有经验，也最成功。但他也指出，TALEN 分子比ZFN大得多，因此很难高效导入。据Voytas介绍，若使用他的Golden Gate试剂盒，用户首先必须确定所需的TALEN结合 位点。之后可从试剂盒中选择每个模块的质粒，这些可在一周之内切割和组装。最后也是最 困难的一步是验证酶是否如想象般起作用。“在某些系统中，功能验证才是真正的关键 点，Voytas谈道。如果你倾向于制备好的TALEN, Cellectis Bioresearch出售定制和预制的酶。据该公司CEO Jean-Charles Epinat介绍，一个未经验证的定制TALEN的价格是3360美元，验证过的是 5000 美元。Life Technologies 也提供定制 TALEN 一 GeneArt Precision TAL。产品是以Gateway兼容的入门克隆提供的，它们编码了一个DNA结合蛋白，可靶定客户提交的特定 序列，并与一系列客户选定的效应物结构域相融合。定制TAL将在下订单后3周内送达。CRISPR/Cas基因组编辑上的新生力量是所谓的CRISPR/Cas系统。这一主题让研究界兴奋无比，目前 在PubMed上有480篇相关的论文，其中160篇是在今年发表的。在CRISPR/Cas9系统中，Cas核酸酶在DNA位点上产生双链断裂，而这一位点是由短的 向导RNA决定的。与其他系统相同，断裂也通过NHEJ或HDR来修复。与ZFN和TALEN不同的是，CRISPR/Cas不是人造的；此系统为细菌提供了适应性免疫 的一种形式。2012年8月，美国加州大学伯克利分校的Jennifer Doudna和德国汉诺威医 学院的Emmanuelle Charpentier在Scienee杂志上发表文章，介绍了此系统如何工作, 并表示可通过更换向导RNA序列来重新编程。从那时起，这一研究就一发不可收拾。这是因为CRISPR/Cas带来了 ZFN和TALEN的若干好处：简单、价格低廉、易于编程且 非常高效。Doudna谈道，有位研究人员一直尝试在小鼠中利用TALEN来进行基因组改造。她用7种 酶来靶定7个位点，尝试数月，无一成功。之后使用Cas9,在三四个星期的时间内，7个 都成功了。哈佛大学的遗传学家George Church也是最早证明该系统在基因组编辑中起作用的科学家 之一。这是来自生物学的真正礼物。”特别值得一提的是，CRISPR/Cas可通过添加多个向导RNA而实现多重编辑。例如，麻省 理工学院的Rudolf Jaeniseh证明了他能够利用5个向导分子在小鼠胚胎干细胞中同时引入 5个突变。与TAL蛋白一样，CRISPR/Cas系统可以通过调整激活和抑制结构域来控制基因表达，而 不是编辑。然而，问题仍然在于系统的特异性（向导RNA序列比ZFN或TALEN所靶定的 大部分序列更短，这意味着脱靶效应的几率更高）。近期发表的一些文章，包括Doud na 和Church的文章，也证明了脱靶效应是真实存在的。据Doudna介绍，脱靶的可能性受很多因素影响，如Cas9的浓度。而Church最近发现， 通过利用Cas9的一种突变形式（只切割单链DNA）和两个紧挨着的向导RNA，有可能大 大提高系统的切割位点保真性。目前，Addgene提供自己动手的CRISPR/Cas试剂。Sigma-Aldrich不久前也推出了相关 产品Sigma CRISPRs。Sigma CRISPRs以单个质粒载体提供，带GFP标记，可快速富集编辑过的细胞，而可定制的向导RNA序列可在线设计。据介绍，单个质粒的价格约为500 美元。