YPD:Difco peptone20 g/LYeast extract10 g/L葡萄糖YPD 固体:20 g/LDifco peptone20 g/LYeast extract10 g/L葡萄糖20 g/LDifco Agar (for plates only)20 g/L调pH至6.5,灭菌条件为高压1210C灭15 min(以下所涉及的需要加入碳源的培养基类型均 与此相同)。YPDA：YPD 冷却至 55oC，添加 5mL/L 0.6% Ade。每升加YMB酵母无氨基氮源67g (威佳)，-leu氨基酸(takara),无水葡萄糖20g,琼脂20g, pH58SMART III Oligo ( 5-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCGGG-3)CDS III Primer (5-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30VN-3)*5 PCR Primer (5-TTCCACCCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGG-3)3 PCR Primer (5-GTATCGATGCCCACCCTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACA-3)AD 5 CTATTCGATGATGAAGATACCCCACCAAACCCAD 3 GTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGAT一、利用CDSIII引物合成单链cDNA1. 灭菌离心管加1 -2ulRNA( 0.025-1.0ug 的 m RNA)1.0 ul CDSIII 引物加入灭菌去离子超纯水至总体积为4.0ul.2. 混匀3. 72C水浴2分钟4.冰水中冷却2 分钟5.轻微离心6.加入一下试剂2.0 ul5X First-Strand Buffer1.0 ulDTT( 20m M)1.0uld NTP (10m M)1.0ulMMLV反转录酶7. 混匀8. 42C水浴10分钟9. 加入1.0ul的BD SMART III寡核苷酸10. 42C水浴1小时（加石腊油）11. 扩增仪上75C放置10分钟，终止合成反应12. 冷却至室温，加入2.0ul（2.0单位）的RNase H.13 37C温浴20分钟。14.-20C条件下放置备用。四、用LD-PCR扩增单链Cdna1. PCR扩增仪预热至95C2. 在离心管加入如下药品2.0ul单链 cDNA70ul去离子超纯水10ul 10XBD Advantage 2 PCR 缓冲液2 ul50Xd NTP Mix2 ul5 PCR 引物2 ul3 PCR 引物10ul10X GC-Melt 溶液2ul50XBD Advantage 2聚合酶混合液3. 小心混匀，轻微离心4. 加2滴灭菌石蜡油5. 扩增程序95C30 secN个循环:95C 10 sec68C 6 min （注意：每个循环过后，退火时间增加5秒68C5min6. 取7ul扩增产物，加Marker，在1.2%的琼脂糖胶电泳，与附录A中图谱对照，检测 扩增结果。7. 20C条件下放置备用。五.用BD CHROMA SPIN TE-400滤柱纯化回收双链cDNA1. 取出滤柱，上下晃动几次，每95ul样品用一个滤柱2. 用食指和拇指夹出滤柱活动管子，把滤柱套入收集管，保存好两端帽子备用。3.700Xg离心5分钟。4. 取下滤柱，丢弃收集管和滤液。5. 滤柱重新套入另一2ml的收集管，小心的把95ul的cDNA样加到滤柱胶面中央，以 免样品从胶面的内侧流出。6. 700Xg离心5分钟。7取下滤柱和收集管，纯化了的cDNA集中在收集管的底部。8. 来自同一样品，纯化了的cDNA放入统一离心管。9. 加入如下试剂：1/10体积 乙酸钠（3M;PH 4.8）2.5 体积 95% 乙醇（一20C）10. 轻微摇匀11. 20C条件下过夜。12. 室温下，14000rpm离心20分钟。13. 小心吸出上清液14. 轻微离心使余液全都集中到离心管底部。15. 小心吸出余液，cDNA小团块在空气中干燥10分钟。16. 用20ul的去离子超纯水溶解cDNA小团块，一20C条件下放置备用。cDNA 文库的建立-YPD培养基加入25%甘油准备PEG/LiAc溶液(参考III部分)lXPEG/LiAc sol: 8ml 50% PEG, 1ml 10xTE, 1ml lOxLiAc,l.lXTE/LiAc:l.lml 10xLiAc, 1.1ml 10xTE, 7.8ml H) (wa ter)1 酵母感受态细胞的准备在YPDA培养基上接种酵母AH109菌株，培养时间W4周，菌落直径为2 3mm 15ml灭菌离心管加3ml的YPDA液体培养基，每管一个菌落，30C, 250rpm, 8h吸取5卩l种子液加入到含有50ml YPDA的250ml三角瓶中30C，250rpm，1620h 测 OD600=0.150.3，将培养液移至 50ml 离心管室温，700rcf, 5min，弃上清液用 100ml YPDA 重悬沉淀，用 500ml 三角瓶摇，30C，250rpm，35h测OD600=0.40.5，将培养液分装到两个50ml离心管，室温，700rcf，5min，弃上清液每管加入30ml去离子超纯水，重悬沉淀，700rcf，5min,去上清用3ml 1.1*TE/LiAc悬浮菌体，吸出与两支1.5ml离心管，12, 000rpm 1530s弃去上清液，每管加入600 Ul 1.1*TE/LiAc重悬沉淀，备用Caution：制出的感受态必须马上使用以下是转化过程16.在一个15ml的离心管里加入如下药品20ulds cDNA6ulpGADT7-Rec (0.54ug/ul)20ulHerring Testes Carrier DNA(已 变性)(Herring Testes Carrier DNA 的变性：离心管加入约 50ul 的 HerringDNA, 100C条件下变性5分钟，迅速在冰水中冷却。加入15ml的离心管前要再重复变性冷却一次)17. 在DNA中加入600ul的感受态酵母细胞18轻轻摇匀19. 加入 2.5ml 的 PEG/LiAc 溶液20. 轻轻摇匀21. 30C条件下温浴45min,每15分钟混匀一次）22. 加入160ul DMSO,摇匀，42C条件水浴20分钟，每10分钟摇匀一次23. 700Xg离心5分钟24. 去掉上清夜，每个管加入3ml的YPD Plus液体培养基（注意：不能用标准的YPD培养 基）25. 30C摇菌90分钟。26. 700Xg离心5分钟27. 去掉上清夜，加入15ml 0.9%的NaCl溶液。在 SD/-Leu 培养基上筛选转化株28. 在准备好的150mm含培养基的培养皿上涂抹150ul的菌液（约需100个）（在100mm SD/-Leu含培养基的培养皿上分别涂抹1： 10，1： 100，1： 1000，和1： 10000 稀释了的菌液，以检测转化的效率）29. 培养皿倒置，在30C条件下培养直至菌落出现，（一般要培养3 6天）30. 计算转化效率：一般要求三1X106转化株/3ug pGADT7-Rec转化株收集31. 培养皿在4C条件下保存34个小时32 .每个培养皿加入5ml冷却的培养基33. 用灭菌的玻璃珠轻轻滚动，把酵母细胞驱进液体34. 把所有的液体导入一个灭菌了的三角瓶里并混匀35. 用血球计检测浓度。如果浓度2X107个细胞/ml,可通过离心减少悬浊液的体积36. 按1ml/管的量分装，在一80C条件下保存备用。（保存时间不能超过1年）37. 在100mm SD/-Leu含培养基的培养皿上分别涂抹按1： 100，1： 1000，和1： 10000稀 比例释了的菌液100ul, 30C条件下培养直至菌落出现（一般要培养2 3天），数菌落数, 估计文库的滴度浓度。酵母质粒抽提按照天根公司提供说明书进行。取一个新长的(2-4天)直径在2-4毫米的菌落，放入3.ml相应的SD液体培养基。使劲摇 晃，使菌落散开，变成浑浊液，在30C条件下，以230 一 250的速度摇菌过夜。14000rpm离心5min,使细胞沉淀，尽量吸除上清液。(3)向菌体沉淀中加入100 u 1山梨醇BUFFER，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮酵母细胞 沉淀。向细胞悬液中加入50U Lyticase溶液，30C放置30-60mins。(5) 6500rpm (4, 000 X g)离心5min,吸除上清，保留沉淀。用250 u 1 YP1溶液(使用前加入RNase)重悬沉淀，彻底悬浮菌体。(7)向管中加入250 u 1 YP2溶液，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。向管中加入350 u 1 YP3溶液，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色 絮状沉淀。13, 000 rpm离心10mins(同时预处理吸附柱CB2:向吸附柱中加入500 u 1的平衡 液BL, 13, 000 rpm离心lmin,倒掉收集管巾的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 小心地将上清液加入吸附柱CB2, 13, 000 rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液， 将吸附柱重新放回收集管中。(10) 向吸附柱CB2中加入500 u 1去蛋白液PD, 13, 000 rpm离心30sec，倒掉废液。(11) 向吸附柱CB2中加入700 u 1漂洗液PW(使用前加入酒精),13, 000 rpm离心30-60sec, 倒掉收集管中的废液。(12) 向吸附柱CB2中加入700 u 1漂洗液PW(使用前加入酒精),13, 000 rpm离心30-60sec, 倒掉收集管中的废液。(13) 将吸附柱CB2重新放回收集管中，13, 000 rpm离心2min，去除吸附柱中残余的漂洗 液，再将吸附柱CB2置于室温或500C温箱放置数分钟，充分去除吸附柱中残余的漂 洗液。(14) 吸附柱CB2放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间不为悬空滴加50-100u1经 65-70C水浴预热的洗脱缓冲液EB,室温放置2min. 13, 000 rpm离心lmin,将质粒 溶液收集到离心管中。(15) 为了提高质粒的回收效率，可将得到的质粒溶液重新加入吸附柱中，重复步骤(14) 。 利用LD-Insert ScreeningAmplimer检测克隆质粒插入片段检测引物序列:AD 5 Primer. 5-CTATTCGATGATGAAGATACCCCACCAAACCC-3.AD 3 Primer. 5-GTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGAT-3.在 0.5ml 耐的灭菌离心管加入如下药品:PCR-grade 去离子水38.6 u ll 0xPCR buffer5 u lAD 5 Primer. ( lOuM)1 u 1AD 3 Primer ( lOuM)1 u 1dNTP Mix (2.SmM ea.)4 u 1