第六章 植物基因工程课程基因工程原原理与技技术班级生物科学005生物技术005教师詹亚光范桂枝学期第二学期课时6学时上课日期课的类型理论授课章节第六章 植植物基因因工程（1）植物物基因转转化受体体系统的的条件（2）植物物基因转转化受体体系统的的类型和和特性。（3）植物物基因工工程载体体的种类类和特性性（4）根癌癌农杆菌菌Ti质粒粒的结构构与功能能：T-DNAA、Virr区操纵纵子的基基因结构构与功能能。（5）农杆杆菌Tii质粒基基因转化化机理（6）农杆杆菌Tii质粒的的改造及及载体构构建（7）载体体构建中中常用的的选择标标记及报报告基因因（8）根癌癌农杆菌菌的转化化程序及及操作原原理（9）外源源基因在在植物中中的表达达教学目的和和要求了解植物基基因转化化受体系系统的类类型、特特性掌握握Ti质粒粒的结构构与功能能，植物物载体构构建原理理，植物物基因工工程常用用的载体体类型。教材分析重点根癌农杆菌菌Ti质粒粒介导的的基因转转化的原原理和方方法难点植物载体构构建原理理关键点转基因植物物的获取取和检测测主要教具和和设备材材料投影仪、电电脑、常常规教学学设备 教法板书与多媒媒体授课课相结合合思考题1. 植物物基因工工程载体体种类？2. 根癌癌农杆菌菌转化程程序？心得 在自然界的的许多双双子叶植植物中，常常常发生生一种严严重危害害植物生生长的病病害冠瘿。已已知900多科，6600多多种双子子叶植物物都能感感染这种种病。一一般认为为单子叶叶植物和和裸子植植物对此此病不敏敏感。770年代代中期，世世界上几几个实验验室发现现诱发肿肿瘤的根根癌农杆杆菌中含含有大量量的诱瘤瘤质粒TTi(ttumoor-iinduucinng pplassmidd),且且证实了了肿瘤的的形成正正是由于于pTii中的特特定片段段TT-DNNA转移移并稳定定地整合合进植物物细胞核核基因组组中的结结果；由由于其上上载着的的冠瘿碱碱合成基基因和激激素合成成基因表表达，因因此分泌泌冠瘿碱碱并形成成肿瘤。人人们就把把这种冠冠瘿的形形成过程程称作天天然的植植物细胞胞转化系系统。农杆菌将自自身的DDNA插插入植物物细胞诱诱发肿瘤瘤只对其其本身是是有益的的，重要要原因之之一是因因为农杆杆菌诱发发植物细细胞合成成冠瘿碱碱为自己己提供食食物。植植物自身身不能利利用这种种物质，只只能为它它的合成成付出代代价，别别的细菌菌也不能能利用它它，在自自然条件件下，只只有农杆杆菌能分分泌分解解冠瘿碱碱的酶，将将这些特特异产物物作为唯唯一的碳碳源和氮氮源来利利用。肿瘤的产生生是由于于T-DDNA上上的激素素合成基基因所致致，刺激激细胞生生长而产产生肿瘤瘤，这是是T-DDNA转转入的一一个副产产品。Ti质粒给给自己设设计出一一套为其其自身存存活的非非常优秀秀的进化化格局：它感染染植物细细胞，使使之出现现愈伤组组织增生生，后者者便产生生出供带带有Tii质粒的的细菌用用作能源源、碳源源和氮源源的冠瘿瘿碱；而而冠瘿碱碱的产生生又可激激发Tii质粒转转移到原原先没有有存在这这种质粒粒的土壤壤农杆菌菌中去，如如此周而而复始得得到不断断发展。Ti质粒是是一类理理想的植植物基因因工程载载体，通通过它们们可以将将外源DDNA转转移到植植物细胞胞，并再再生出能能够表达达外源基基因的转转基因植植物。Ti质粒还还具有若若干其他他载体所所不具备备的优点点：（11）T-DDNA能能够进行行高频的的转移，而而且这种种转移的的DNAA通常是是以未发发生变化化的完整整形式整整合到植植物的核核基因组组上。（2）Ti质粒不存在包装限制问题，大到50kb的外源DNA也能顺利地包装与转移。一、植物基基因工程程载体种种类据载体的功功能和构构建过程程，可把把有关载载体分为为四大类类型（九九种载体体）。克隆载体、中中间载体体、卸甲甲载体、转转化载体体据载体的功功能和构构建过程程，可把把有关载载体分为为四大类类型，九九种载体体。1、克隆载载体（目目的基因因的克隆隆载体）通常由多拷拷贝的EE.cooli小小质粒为为载体功能：保存存和克隆隆目的基基因。2、中间载载体又分分为中间间克隆载载体和中中间表达达载体。 中间克隆隆载体：由大肠肠杆菌质质粒插入入T-DDNA片片段及目目的基因因、标记记基因等等构建而而成。功能：构建建中间表表达载体体的基础础。分为：中间间粘粒载载体、质质粒粘粒粒愈合载载体、基基因标记记载体。 中间表达达载体：含有植植物特异异启动子子的中间间载体功能：作为为构建转转化载体体的质粒粒。3、卸甲载载体解除武装的的Ti质粒粒或Rii质粒。（onc+ - onc-）功能：作为为转化载载体的受受体质粒粒4、转化载载体最后用于目目的基因因导入植植物细胞胞的载体体，亦称称工程载载体。它是由中间间表达载载体和卸卸甲载体体构建而而成。分为一元载载体系统统（顺式式载体）和和双元转转化载体体系统（反反式载体体）。一元载体系系统包括括共整合合载体和和拼接末末端载体体（SEEV）。二、根癌农农杆菌TTi质粒粒1、Ti质质粒的类类型、结结构与功功能（1）类型型Ti质粒是是根癌农农杆菌染染色体以以外的遗遗传物质质，为双双股共价价闭合的的环状DDNA分分子，分分子量为为951566 x 1006D，约约1500 2000 Kbb长。根根据其诱诱导的冠冠瘿碱种种类不同同，Tii质粒可可分为三三类：章鱼碱型（octopine）：pTiAch5, pTiA6NC, pTiB653, pTiAg162胭脂碱型（nopaline）：pTiT37, pTiT38, pTiC58农杆碱型（agropine）和农杆碱素型（agrocinopine）或琥珀碱型（succinamopine）（2）结构构和功能能各种Ti质质粒都可可分为四四个区：T-DNNA区（trranssferrredd-DNNA rregiionss）：是是农杆菌菌侵染植植物细胞胞时，从从Ti质粒粒上切割割下来转转移到植植物细胞胞的一段段DNAA。该DNNA片段段上的基基因与肿肿瘤的形形成有关关。Vir区区（Viirullencce rregiion）：该区段段上的基基因能激激活T-DNAA转移，使使农杆菌菌表现出出毒性，故故称之为为毒性区区。T-DNAA区与viir区在在质粒上上彼此相相邻，合合起来约约占Tii质粒DNNA的1/33。Con区区（reegioon oof rrepllicaatioon）：质粒结结合转移移位点编编码区，该该区段上上存在着着与细菌菌间接合合转移的的有关基基因（ttra），调调控Tii质粒在在农杆菌菌之间的的转移。冠冠瘿碱能能激活ttra基基因，诱诱导Tii质粒转转移，因因此，称称之为接接合转移移编码区区。Ori区区（orrigiin of reepliicattionn）：该该区段基基因调控控Ti质粒粒的自我我复制，称称之为复复制起始始区。3种成分与与Ti质粒粒肿瘤诱诱导有关关:T-DNAA：它可可转移至至宿主细细胞，是是一种可可移动因因子。毒性区：vvir基基因可产产生转移移活动蛋蛋白，对对增强植植物细胞胞的转化化是必须须的。土壤农癌杆杆菌染色色体基因因:间接参参与转化化，负责责将细菌菌细胞接接合于植植物上。2、T-DDNA的的基因结结构和功功能（1）T-DNAA的结构构特点长约23KKb在T-DNNA的5和3端都都有真核核表达信信号，如如TATTAboox，AATTAAbbox及及pollyA等等。 T-DNAA的两端端左右边边界各为为25bbp的重重复序列列，即边边界序列列，分别别称之为为左边界界（BLL或TL）和和右边界界（BRR或TR）。该该25bbp边界界序列属属保守序序列（TTGACCACGGATAATATT TGGGCGGGGTTAAAAC）。通通常右边边界序列列更为保保守，左左边界在在某些情情况下有有所变化化。左边边界的缺缺失突变变仍能致致瘤，但但右边界界缺失则则不致瘤瘤，这时时几乎完完全没有有T-DDNA的的转移，这这说明右右边界在在T-DDNA的的转移中中的重要要性。胭脂碱型肿肿瘤，为为一连续续的一段段序列，长长约233.4KKb，有有肿瘤系系，仅一一个拷贝贝，有的的T-DDNA是是多拷贝贝的。章鱼碱型肿肿瘤：TT-DNNA分左左右两部部分（TTL-DDNA和和TR-DNAA），各各自带有有左右边边界序列列。左区区的顺序序变化不不大，长长度约113Kbb，通常常一个拷拷贝，但但也有几几个拷贝贝首尾相相连排列列。含章章鱼碱合合成酶基基因和致致瘤基因因。TRR-DNNA较短短，长约约6-77Kb，拷拷贝数达达数个 或数十十个，有有的肿瘤瘤系中没没有TRR-DNNA。TR-DNAA编码5个基因因，如甘甘露碱和和冠瘿碱碱合成酶酶基因。（2）T-DNAA上的编编码基因因及功能能 章鱼碱碱型和胭胭脂碱型型T-DDNA的的转录有有下述共共同特点点：T-DNAA的两条条链都是是有意义义链；T-DNAA上每个个基因都都有各自自的启动动子；基因的转录录由植物物细胞RRNA聚聚合酶III完成成；T-DNAA具典型型的真核核生物RRNA合合成起始始和终止止的调节节信号，在在其5端转录录起始处处有TAATA和和CAAAT盒。另另外，至至少在55个T-DDNA基基因中发发现有一一个8bbp的相相同顺序序（TTTTCAAA GGA），同同时AAATAAAA加尾尾信号也也在同一一条链上上发现。植物或农杆杆菌中可可能有甲甲基化或或去甲基基化的调调节基因因活性。3、Virr区操纵纵子的基基因结构构与功能能毒性区的大大多数基基因产物物都控制制T-DDNA的的转移，这这个区域域的突变变往往导导致农杆杆菌感染染植物能能力的下下降。（1）Viir区操操纵子的的基因结结构章鱼碱型TTi质粒粒：Viir区大大小为440kbb，含有有VirrA、B、C、D、E、F、G、H（PinnF）等等8个操纵纵子，共共24个基基因。大大多数操操纵子含含有多个个基因VVirAA（1）、ViirB（11）、ViirC（2）、ViirD（4）VirrE（2）、ViirF（1）、ViirH（2）。胭脂碱型TTi：有有7个操纵纵子，少少一个VVirFF，它们们的第一一个操纵纵子也不不同，章章鱼碱型型Ti是VirrH，而而胭脂碱碱型Tii是Tzss，其功功能也不不同。Vir区基基因的表表达有两两种方式式：组成型表达达；在无无植物诱诱导分子子存在下下依然保保持一定定的表达达水平，virA，virG、virH诱导型表达达：这些些基因的的表达必必须在土土壤农杆杆菌感染染植物时时，在植植物受伤伤组织分分泌的信信号分子子作用下下才能启启动表达达，如vvirBB、C、D、EvirG虽虽属于组组成型表表达，但但有植物物信号分分子存在在下表达达量提高高10倍，也也具诱导导表达特特性。（2）Viir区操操纵子的的基因的的功能Vir A 单个基基因，22.4kkb，仅仅编码一一条多肽肽。Viir AA编码一一种结合合在膜上上的化学学受体蛋蛋白（992KDD），可可直接对对植物产产生的酚酚类化合合物感应应，是一一种感应应蛋白。Vir AA的活化化：当AAS与Virr A的的受体部部分结合合后，会会使整个个Virr A蛋蛋白构象象发生变变化，其其C端活化化。Viir AA蛋白的的胞质区区有自激激酶的功功能，可可在保守守的组氨氨酸残基基上