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大肠埃希菌检查法大肠埃希菌检查法 Escherichia Coli Test Method 1.目的 建立大肠埃希菌检查法的标准操作程序。 2.范围 适用于大肠埃希菌检查的操作。 3.责任者 QC化验员。 4.程序: 4.1.简述 4.1.1. 大肠埃希菌(Escherichia coli)即大肠埃希菌,为肠埃希菌科埃希菌属的模式种。埃希菌属除大肠埃希菌外,新近发现有非脱羧埃希氏菌等5个种。大肠埃希菌是人和温血动物肠道内的栖居菌,随粪便排出体外。在药品中检出大肠埃希菌,表明该样品受到人和温血动物的粪便污染,即可能污染肠道病原体。大肠埃希菌除普通大肠埃希菌外尚有致病性大肠埃希菌,可引起婴幼儿、成人爆发性腹泻。为保证人体健康,口服药品必须检查大肠埃希菌。 4.1.2. 用4-甲基伞形酮葡糖苷酸(4-Methylumbelliferyl-D-glucuronide,MUG)和靛基质(Indole)试验检查大肠埃希菌是一项新技术,其检验步骤为:增菌培养后,转种MUG-蛋白胨培养基培养,多数情况下不需要从混合菌中分离单个菌,如MUG、Indole试验为阳性或阴性即可报告结果。 4.1.3. 原理:利用目标菌限定酶作用的底物的水解产物,产生颜色或荧光反应作为指示系统来鉴定目标菌。 实验证明,96的大肠埃希菌含-葡糖苷酸酶(-glucuronidase,GUD),约10的沙门菌属一些菌种也含有此酶。MUG被GUD水解,产生荧光,由于荧光反应的敏感度较颜色反应强千万倍,易于观察,没有主观性,因而用MUG鉴定大肠埃希菌已被广泛应用于临床、食品、饮水、污水等的检测。单一的MUG鉴别大肠埃希菌其漏检率达6,鉴于98的大肠埃希菌其靛基质试验为阳性,故将MUG与靛基质试验结合,比单用MUG可提高大肠埃希菌的检出率。如MUG与Indole试验的反应不一致时,则需将供试液的增菌培养物用EMB琼脂平板分离培养、革兰染色、镜检及生化试验鉴别。该法理论上可使大肠埃希菌的检出率达98。如仅用IMViC生化试验来鉴别大肠埃希菌属中的大肠埃希菌,其结果是含混的。 4.2.仪器、设备及用具 4.2.1. 无菌室 4.2.2. 净化工作台 4.2.3. 培养箱(361) 4.2.4. 高压蒸汽灭菌器 4.2.5. 显微镜(1500X) 4.2.6. 微波炉 4.2.7. 恒温水浴 4.2.8. 离心机(5004000r/min) 4.2.9. 0.45m0.02m薄膜及过滤器 4.2.10. 电冰箱 4.2.11. 匀浆仪 4.2.12. 366nm紫外灯 4.2.13. 玻璃器皿、器具 4.3.试液、指示液 4.3.1. 0.9无菌氯化钠溶液 取氯化钠9.0g,加水使溶解成1000ml,121灭菌20分钟。 4.3.2. 靛基质试液 取氯化二甲氨基苯甲醛5.0g,加入戊醇(或丁醇)75ml,充分振摇,使完全溶解后,再取浓盐酸25ml徐徐滴入,边加边振摇,以免聚热导致溶液色泽变深,或取对二甲氨基苯甲醛1.0g,加入95乙醇95ml,充分振摇,使完全溶解后,取浓盐酸20ml徐徐滴入。 4.3.3. 甲基红指示液 取甲基红0.1g,加95乙醇300ml,使溶解后加水至500ml,即得。 4.3.4. V-P试液 -萘酚乙醇试液:取萘酚6.0g,加无水乙醇溶解使成100ml。 氢氧化钾试液:取氢氧化钾40.0g、加水使溶解成100ml。 4.3.5. 革兰染色液 4.3.5.1. 结晶紫染液 取结晶紫1.0g、95乙醇20ml、1草酸铵(NH4)2C2O4溶液80ml。将结晶紫溶于乙醇后,与草酸铵混合,静置48h,置密闭棕色瓶,可存放数月。 4.3.5.2. 革兰碘液 碘1.0g、碘化钾2.0g、蒸馏水300ml。用少量水溶碘化钾,再加碘,待全溶后,加蒸馏水至30ml,置棕色瓶备用。 4.3.5.3. 脱色液 95乙醇 4.3.5.4. 沙黄(番红)染液 沙黄(SafranineO)0.25g、95乙醇10ml、蒸馏水适量,将沙黄加入乙醇中,完全溶解后再加水至100ml。 4.3.6. 亚甲蓝指示液 取亚甲蓝0.5g,加水溶解使成100ml。 4.3.7. 溴麝香草酚蓝指示液 取溴麝香草酚蓝0.4g,加1mol/L氢氧化钠溶液0.64ml使溶解,再加水稀释至100ml。变色范围pH6.07.6(黄红) 4.3.8. 酸性品红指示液 取酸性品红0.5g,加水100ml溶解,再逐渐加1mol/L氢氧化钠溶液16ml,每加1滴需将溶液充分摇匀后再加第二滴,直至溶液呈草黄色;于沸水中保持15分钟,静置2小时,滤过,即得。变色范围pH6.07.4(黄红)。 4.3.9. 曙红钠指示液 取曙红钠2.0g,加水溶解使成100ml。 4.3.10. 无菌聚山梨酯80-氯化钠溶液 取聚山梨酯80 1ml加0.9氯化钠溶液使成100ml,121灭菌20分钟。 4.3.11. 无菌磷酸盐缓冲液(pH7.2) 取磷酸氢二钠25.8g与磷酸二氢钠4.4g,加水稀释至1000ml,121灭菌20分钟。 4.3.12. 无菌对氨基苯甲酸试液 取对氨基苯甲酸0.1g,加入含10ml水的具塞试管中,121灭菌20分钟。 4.3.13. 中性红指示液 取中性红1.0g,研细,加95%乙醇60ml使溶解,再加水至100ml。变色范围 Ph6.88.0。 4.3.14. 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(pH7.0) 取磷酸二氢钾3.56g,磷酸氢二钠7.23g,氯化钠4.30g,蛋白胨1.0g,加水1000ml,加热使溶解,过滤。分装,灭菌。 4.4.培养基 4.4.1. 营养肉汤培养基 胨 10g 氯化钠 5.0g 牛肉浸出粉 3.0g 水 1000ml 取上述成份混合,微温溶解,调解pH为弱碱性,煮沸,调节pH值使灭菌后为7.20.2,分装,灭菌。 4.4.2. 营养琼脂培养基 胨 10g 氯化钠 5.0g 牛肉浸出粉 3.0g 水 1000ml 琼脂 14.0g 取上述成份混合,微温溶解,调解pH为弱碱性,煮沸,滤清,调节pH值使灭菌后为7.20.2,分装,灭菌。 4.4.3. 胆盐乳糖培养基 胨 20.0g 磷酸二氢钾 1.3g 乳糖 5.0g 牛胆盐 2.0g 氯化钠 5.0g (0.5g) 磷酸氢二钾 4.0g 水 1000ml 除乳糖、牛胆盐或去氧胆酸钠外,取上述成分,混合,微温溶解,调节pH值使灭菌后为7.40.2,煮沸,滤清,加入乳糖、牛胆盐或去氧胆酸钠,分装,灭菌。 4.4.4. 4-甲基伞形酮葡萄糖化酶苷酸培养基 胨 10.0g 磷酸二氢钾 0.9g 硫酸锰 0.5mg 磷酸氢二钠 6.2g 硫酸锌 0.5mg 亚硫酸钠 40mg 硫酸镁 0.1g 去氧胆酸钠 1.0g 氯化钠 5.0g MUG 75mg 氯化钙 50mg 水 1000ml 除MUG外,取上述成分,混合,微温溶解,调节pH值使灭菌后为7.30.1,加入MUG,溶解,每管分装5ml,灭菌。 4.4.5. 曙红亚甲基蓝琼脂培养基 营养琼脂培养基 100ml 曙红钠指示液 2ml 20%乳糖溶液 5ml 亚甲蓝指示液 1.3-1.6ml 取营养琼脂培养基,加热溶化后,冷至60,按无菌操作加入灭菌的其他 3种溶液,摇匀,倾注平皿。 4.4.6. 麦康凯琼脂培养基 胨 20.0g 1%中性红指示液 3ml 乳糖 10.0g 琼脂 14.0g 牛胆盐 5.0g 水 1000ml 氯化钠 5.0g 除乳糖1%中性红指示液、牛胆盐及琼脂外,取上述成分,混合,微温溶解,调节pH值使灭菌后为7.20.2,加入琼脂,加热溶化后,再加入其余各成分,摇匀,分装,灭菌,冷至约60,倾注平皿。 4.4.7. 蛋白胨水培养基 胰蛋白胨 10g 氯化钠 5g 水 1000ml 取上述成分混合,加热溶化,调节pH使灭菌后为7.30.1,分装于小试管,灭菌。 4.4.8. 磷酸盐葡萄糖胨水培养基 胨 7g 磷酸氢二钾 2g 葡萄糖 5g 水 1000ml 取上述成分混合,微温溶解,调节pH使灭菌后为7.30.1,分装于小试管,灭菌。 4.4.9. 枸橼酸盐培养基 氯化钠 5g 枸橼酸钠 2g 硫酸镁 0.2g 溴麝香草酚蓝指示液 20ml 磷酸氢二钾 1g 琼脂 14g 硫酸二氢铵 1g 水 1000ml 除指示液和琼脂外,取上述成分混合,微温溶解,调节pH使灭菌后为6.90.1,加入琼脂,加热溶化,加入指示液,混匀。分装于小试管,灭菌,制成斜面。注:所用琼脂应不含游离糖,用前用水浸泡冲洗。 4.4.10. 乳糖培养基 胨 20.0g 乳糖 10.0g 0.04%溴甲酚紫指示液 25ml 水 1000ml 除0.04%溴甲酚紫指示液外,取上述成分,混合,微温溶解,调节pH使灭菌后为7.20.2,加入指示液,分装于含倒管的小试管中,每管3ml。灭菌。 5%乳糖培养基 胨 0.2g 溴麝香草酚蓝指示液 6ml 氯化钠 0.2g 乳糖 5g 磷酸氢二钠 0.2g 水 100ml 除乳糖和指示液外,混合各成分,微温溶解,调节pH使灭菌后为7.4,加入乳糖/指示液,混合,分装于含小倒管的灭菌小试管中,115灭菌15min。 4.5.对照用菌液 取大肠埃希菌CMCC(B)44102的营养琼脂斜面培养物少许,接种至5ml营养肉汤培养基内,置361培养1824小时,取均匀培养物1 m
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