大肠埃希菌检查法大肠埃希菌检查法 Escherichia Coli Test Method 1.目的 建立大肠埃希菌检查法的标准操作程序。 2.范围 适用于大肠埃希菌检查的操作。 3.责任者 QC化验员。 4.程序： 4.1.简述 4.1.1. 大肠埃希菌(Escherichia coli)即大肠埃希菌，为肠埃希菌科埃希菌属的模式种。埃希菌属除大肠埃希菌外，新近发现有非脱羧埃希氏菌等5个种。大肠埃希菌是人和温血动物肠道内的栖居菌，随粪便排出体外。在药品中检出大肠埃希菌，表明该样品受到人和温血动物的粪便污染，即可能污染肠道病原体。大肠埃希菌除普通大肠埃希菌外尚有致病性大肠埃希菌，可引起婴幼儿、成人爆发性腹泻。为保证人体健康，口服药品必须检查大肠埃希菌。 4.1.2. 用4-甲基伞形酮葡糖苷酸(4-Methylumbelliferyl-D-glucuronide，MUG)和靛基质(Indole)试验检查大肠埃希菌是一项新技术，其检验步骤为：增菌培养后，转种MUG-蛋白胨培养基培养，多数情况下不需要从混合菌中分离单个菌，如MUG、Indole试验为阳性或阴性即可报告结果。 4.1.3. 原理：利用目标菌限定酶作用的底物的水解产物，产生颜色或荧光反应作为指示系统来鉴定目标菌。 实验证明，96的大肠埃希菌含-葡糖苷酸酶(-glucuronidase，GUD)，约10的沙门菌属一些菌种也含有此酶。MUG被GUD水解，产生荧光，由于荧光反应的敏感度较颜色反应强千万倍，易于观察，没有主观性，因而用MUG鉴定大肠埃希菌已被广泛应用于临床、食品、饮水、污水等的检测。单一的MUG鉴别大肠埃希菌其漏检率达6，鉴于98的大肠埃希菌其靛基质试验为阳性，故将MUG与靛基质试验结合，比单用MUG可提高大肠埃希菌的检出率。如MUG与Indole试验的反应不一致时，则需将供试液的增菌培养物用EMB琼脂平板分离培养、革兰染色、镜检及生化试验鉴别。该法理论上可使大肠埃希菌的检出率达98。如仅用IMViC生化试验来鉴别大肠埃希菌属中的大肠埃希菌，其结果是含混的。 4.2.仪器、设备及用具 4.2.1. 无菌室 4.2.2. 净化工作台 4.2.3. 培养箱(361) 4.2.4. 高压蒸汽灭菌器 4.2.5. 显微镜(1500X) 4.2.6. 微波炉 4.2.7. 恒温水浴 4.2.8. 离心机(5004000r/min) 4.2.9. 0.45m0.02m薄膜及过滤器 4.2.10. 电冰箱 4.2.11. 匀浆仪 4.2.12. 366nm紫外灯 4.2.13. 玻璃器皿、器具 4.3.试液、指示液 4.3.1. 0.9无菌氯化钠溶液 取氯化钠9.0g，加水使溶解成1000ml，121灭菌20分钟。 4.3.2. 靛基质试液 取氯化二甲氨基苯甲醛5.0g，加入戊醇(或丁醇)75ml，充分振摇，使完全溶解后，再取浓盐酸25ml徐徐滴入，边加边振摇，以免聚热导致溶液色泽变深，或取对二甲氨基苯甲醛1.0g，加入95乙醇95ml，充分振摇，使完全溶解后，取浓盐酸20ml徐徐滴入。 4.3.3. 甲基红指示液 取甲基红0.1g，加95乙醇300ml，使溶解后加水至500ml，即得。 4.3.4. V-P试液 -萘酚乙醇试液：取萘酚6.0g，加无水乙醇溶解使成100ml。 氢氧化钾试液：取氢氧化钾40.0g、加水使溶解成100ml。 4.3.5. 革兰染色液 4.3.5.1. 结晶紫染液 取结晶紫1.0g、95乙醇20ml、1草酸铵(NH4)2C2O4溶液80ml。将结晶紫溶于乙醇后，与草酸铵混合，静置48h，置密闭棕色瓶，可存放数月。 4.3.5.2. 革兰碘液 碘1.0g、碘化钾2.0g、蒸馏水300ml。用少量水溶碘化钾，再加碘，待全溶后，加蒸馏水至30ml，置棕色瓶备用。 4.3.5.3. 脱色液 95乙醇 4.3.5.4. 沙黄(番红)染液 沙黄(SafranineO)0.25g、95乙醇10ml、蒸馏水适量，将沙黄加入乙醇中，完全溶解后再加水至100ml。 4.3.6. 亚甲蓝指示液 取亚甲蓝0.5g，加水溶解使成100ml。 4.3.7. 溴麝香草酚蓝指示液 取溴麝香草酚蓝0.4g，加1mol/L氢氧化钠溶液0.64ml使溶解，再加水稀释至100ml。变色范围pH6.07.6(黄红) 4.3.8. 酸性品红指示液 取酸性品红0.5g，加水100ml溶解，再逐渐加1mol/L氢氧化钠溶液16ml，每加1滴需将溶液充分摇匀后再加第二滴，直至溶液呈草黄色；于沸水中保持15分钟，静置2小时，滤过，即得。变色范围pH6.07.4(黄红)。 4.3.9. 曙红钠指示液 取曙红钠2.0g，加水溶解使成100ml。 4.3.10. 无菌聚山梨酯80-氯化钠溶液 取聚山梨酯80 1ml加0.9氯化钠溶液使成100ml，121灭菌20分钟。 4.3.11. 无菌磷酸盐缓冲液(pH7.2) 取磷酸氢二钠25.8g与磷酸二氢钠4.4g，加水稀释至1000ml，121灭菌20分钟。 4.3.12. 无菌对氨基苯甲酸试液 取对氨基苯甲酸0.1g，加入含10ml水的具塞试管中，121灭菌20分钟。 4.3.13. 中性红指示液 取中性红1.0g，研细，加95%乙醇60ml使溶解，再加水至100ml。变色范围 Ph6.88.0。 4.3.14. 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(pH7.0) 取磷酸二氢钾3.56g，磷酸氢二钠7.23g，氯化钠4.30g，蛋白胨1.0g，加水1000ml，加热使溶解，过滤。分装，灭菌。 4.4.培养基 4.4.1. 营养肉汤培养基 胨 10g 氯化钠 5.0g 牛肉浸出粉 3.0g 水 1000ml 取上述成份混合，微温溶解，调解pH为弱碱性，煮沸，调节pH值使灭菌后为7.20.2，分装，灭菌。 4.4.2. 营养琼脂培养基 胨 10g 氯化钠 5.0g 牛肉浸出粉 3.0g 水 1000ml 琼脂 14.0g 取上述成份混合，微温溶解，调解pH为弱碱性，煮沸，滤清，调节pH值使灭菌后为7.20.2，分装，灭菌。 4.4.3. 胆盐乳糖培养基 胨 20.0g 磷酸二氢钾 1.3g 乳糖 5.0g 牛胆盐 2.0g 氯化钠 5.0g (0.5g) 磷酸氢二钾 4.0g 水 1000ml 除乳糖、牛胆盐或去氧胆酸钠外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH值使灭菌后为7.40.2，煮沸，滤清，加入乳糖、牛胆盐或去氧胆酸钠，分装，灭菌。 4.4.4. 4-甲基伞形酮葡萄糖化酶苷酸培养基 胨 10.0g 磷酸二氢钾 0.9g 硫酸锰 0.5mg 磷酸氢二钠 6.2g 硫酸锌 0.5mg 亚硫酸钠 40mg 硫酸镁 0.1g 去氧胆酸钠 1.0g 氯化钠 5.0g MUG 75mg 氯化钙 50mg 水 1000ml 除MUG外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH值使灭菌后为7.30.1，加入MUG，溶解，每管分装5ml，灭菌。 4.4.5. 曙红亚甲基蓝琼脂培养基 营养琼脂培养基 100ml 曙红钠指示液 2ml 20%乳糖溶液 5ml 亚甲蓝指示液 1.3-1.6ml 取营养琼脂培养基，加热溶化后，冷至60，按无菌操作加入灭菌的其他 3种溶液，摇匀，倾注平皿。 4.4.6. 麦康凯琼脂培养基 胨 20.0g 1%中性红指示液 3ml 乳糖 10.0g 琼脂 14.0g 牛胆盐 5.0g 水 1000ml 氯化钠 5.0g 除乳糖1%中性红指示液、牛胆盐及琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH值使灭菌后为7.20.2，加入琼脂，加热溶化后，再加入其余各成分，摇匀，分装，灭菌，冷至约60，倾注平皿。 4.4.7. 蛋白胨水培养基 胰蛋白胨 10g 氯化钠 5g 水 1000ml 取上述成分混合，加热溶化，调节pH使灭菌后为7.30.1，分装于小试管，灭菌。 4.4.8. 磷酸盐葡萄糖胨水培养基 胨 7g 磷酸氢二钾 2g 葡萄糖 5g 水 1000ml 取上述成分混合，微温溶解，调节pH使灭菌后为7.30.1，分装于小试管，灭菌。 4.4.9. 枸橼酸盐培养基 氯化钠 5g 枸橼酸钠 2g 硫酸镁 0.2g 溴麝香草酚蓝指示液 20ml 磷酸氢二钾 1g 琼脂 14g 硫酸二氢铵 1g 水 1000ml 除指示液和琼脂外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH使灭菌后为6.90.1，加入琼脂，加热溶化，加入指示液，混匀。分装于小试管，灭菌，制成斜面。注：所用琼脂应不含游离糖，用前用水浸泡冲洗。 4.4.10. 乳糖培养基 胨 20.0g 乳糖 10.0g 0.04%溴甲酚紫指示液 25ml 水 1000ml 除0.04%溴甲酚紫指示液外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH使灭菌后为7.20.2，加入指示液，分装于含倒管的小试管中，每管3ml。灭菌。 5%乳糖培养基 胨 0.2g 溴麝香草酚蓝指示液 6ml 氯化钠 0.2g 乳糖 5g 磷酸氢二钠 0.2g 水 100ml 除乳糖和指示液外，混合各成分，微温溶解，调节pH使灭菌后为7.4，加入乳糖/指示液，混合，分装于含小倒管的灭菌小试管中，115灭菌15min。 4.5.对照用菌液 取大肠埃希菌CMCC(B)44102的营养琼脂斜面培养物少许，接种至5ml营养肉汤培养基内，置361培养1824小时，取均匀培养物1 m