第14章 DNA的复制、修复与重组一、学大纲基本要求DNA的复制过程、损伤与修复、DNA重组类型。DNA的复制过程中的半保留复制，复制起点和复制方式，DNA聚合反应有关的酶，DNA的半不连续复制，DNAM制的拓扑性质，DNAM制体的结构，大肠杆菌DNA 复制的过程，真核生物 DNA的复制，DNA复制的调控。DNA的损伤及修复，错配修复，光复活，切除修复， 重组修复，应急反应及易错修复。DNA的重组，同源重组，特异位点重组和转座重组。、本章知识要点(一) DNA的复制1、DNA的半保留复制(semiconservative replication )复制时DNA的两条链分开，分别作为模板合成新的互补链而形成两个DNA分子。子代DNA分子的一条链来自亲代DNA另一条则是新合成的。2、DNAM制的起点和方式基因组能独立进行复制的单位称为复制子。每个复制子都含有复制起点和终点。在复制的部位形成叉形结构，称为复制叉。复制方向大多数是定点双向，起点一个或多个(原核生物1个起点，真核生物多个起点)。DNA复制的方式有：单起点双方向，多起点双方向，环状DNA)型双方向，环状 DNA0型单方向，滚动环式(噬菌体 $ X174DNA和D-环式(线粒体 DNA是单向复制的特殊方式。3、DNA聚合反应有关的酶(1) DNA聚合反应n idATP+n 2dGTP+n 3dCTP+n 4dTTPDNA聚合酶2+DNA模板，RNA引物，Mg厂 dAMfIdGMPIdCMPIdTMP+ ( ni+ n2+ n3+ n4)PPi(2) 引物酶：合成 RNA引物，弓I物酶与有关蛋白质形成引发体(2)DNA聚 合酶大肠杆菌DNA聚合酶有五种:DNA聚合酶IDNA聚合酶nDNA聚合酶川5/宀3/聚合作用+ +3/宀5/外切酶+ +5/宀3/外切酶+ -+主要功能DNA的损伤修复DNA的损伤修复DNA复制酶RNA引物切除并聚合DNA聚合酶和V涉及 DNA的错误倾向修复。当 DNA受到较严重损伤时，可诱导产生这两个酶, 它们能在损伤部位继续复制而造成错误倾向的复制。哺乳动物DNA聚合酶有五种:DNA聚合酶a (I)NA聚合酶3 (W)DNA聚合酶 DN丫 (MIA聚合酶5(川)DNA聚合酶& (n)细胞定位细胞核细胞核线粒体细胞核细胞核5t 3聚合作用+ + +3t 5 外切酶- -+ +5t 3 外切酶- - -功能引物合成修复线粒体DNA合成核 DNA合成修复(4) DNA连接酶：催化双链 DNA切口处形成磷酸二酯键，大肠杆菌的DNA连接酶以NAD +提供能量，动物细胞和噬菌体的连接酶以ATP提供能量(5) 拓扑异构酶H:引入负超螺旋，使DNA解旋(6) 解螺旋酶：使 DNA双链中的氢键断开(7) 单链结合蛋白(SSB：稳定DNA解开的单链4、 DNA的半不连续复制(semidiscontinuous replication)在体内，DNA的两条链都能作为模板，合成出两条新的互补链。由于DNA分子的两条链是反向平行的，而DNA聚合酶的合成方向是3 /,所以DNA复制时，一条新生链连续合成，另一条新生链沿5/宀3/不连续合成，这种方式称半不连续复制。以复制叉向前移动的方向为标准，一条模板链是5 /走向，其子代链沿3 /连续合成，称为前导链(leading strand );另一条模板链是 5 3 /走向，其子代链沿 53 /不连续合成，称为 滞后链(lagging strand )。DNA复制过程中形成的 DNA片段称冈崎片段(Okazaki fragment )。5、DNA复制的拓扑性质拓扑异构酶控制着 DNA的拓扑结构(DNA分子结构的空间关系)。拓扑异构酶分为两类：拓扑异构 酶I能使DNA的一条链发生断裂和再连接，反应无需供能，主要集中在转录活性区，同转录有关；酶n能 使DNA的两条链同时发生断裂和在连接，反应需ATP供能，分布在染色质骨架蛋白和核基质部位，同复制有关。原核生物拓扑异构酶n可引入负超螺旋，消除复制叉前进时带来的扭曲张力，促进双链的解开；拓 扑异构酶I可减少负超螺旋。6、DNA复制体的结构细菌和真核生物复制体的组成组成细菌真核生物复制酶DNA聚合酶川全酶DNA聚合酶a /DNA聚合酶5进行性因子3夹子(3亚基)PCNA(增殖细胞核抗原)定位因子丫复合物(丫 2 55 X“)RF-C引物合成酶Dn aGDNA聚合酶a去除引物RNaseH 和 DNA聚合酶 IRnaseHI和 MF-1(5 t 3 外切酶)滞后链修复DNA聚合酶I和DNA!接酶DNA聚合酶和Dna!接酶I解螺旋酶Dn aB(疋位需要Dn aCT抗原消除拓扑张力旋转酶拓扑异构酶n单链结合SSBRP-A7、DNA复制的过程大肠杆菌DNA复制的过程：(1) 复制的起始：Dna A识别起点序列，在起点特异位置解开双链宀Dna B (解螺旋酶)、Dna C、DNA旋转酶和 SSB配合作用使双链解开 t Dna G (引物合成酶)合成 RNA引物(2) 复制的延伸：先导链的延伸：沿 5t3 方向连续合成滞后链的延伸：冈崎片段的合成tDNA聚合酶I切除引物并聚合填补t DNA片段的延伸（3）复制的终止细菌环状染色体的两个复制叉向前推移，最后在终止区（ter位点）相遇并停止复制8、真核生物DNA的复制真核细胞与原核细胞 DNA复制的不同细胞真核细胞原核细胞复制子1000个以上1个DNA聚合酶a、3 （均不具外切酶活性）丫、S （具3xt 5 /外切酶活性）、i、n、m（具外切酶活性）速度较慢(1 000-3 000bp/mi n)较快(50 000bp/min)真核生物线性染色体的两个末端具有特殊的结构 端粒，端粒的功能：稳定染色体末端结构，防 止染色体间末端连接，补偿滞后链5/末端在消除RNA引物后造成的空缺。端粒是由端粒酶合成的。9、DNA复制的调控DNA复制的调节发生在起始阶段。Dam甲基化酶在大肠杆菌 DNA复制起始的调节控制中起关键性作用。真核生物DNA的复制受复制许可因子的控制。（二）DNA的损伤修复造成DNA损伤的原因可能是物理因素：如紫外线、电离辐射等，化学因素：如碱基类似物（5-溴尿嘧啶）、碱基修饰剂（亚硝酸、羟胺、烷化剂）、嵌入染料（吖啶橙、原黄素、嗅化乙锭）。损伤的结果是突变或死亡。突变的表现：碱基对置换、插入碱基和碱基缺失。DNA的修复有以下修复系统：1、错配修复DNA在复制过程中发生错配，错配修复系统能够识别错配位点以及“新”“旧”链，将错配新链切除并加以修复。2、光复活光复活是直接修复的一种形式。可见光（最有效波长为400nm左右）可激活光复活酶，它能分解紫外线引起的嘧啶二聚体。高等哺乳类中没有光复活酶。3、切除修复（暗修复，复制前修复）切除修复包括碱基切除修复和核苷酸切除修复，是一系列酶促反应碱基缺陷或错配T切掉（N-糖苷酶）T切除（AP核酸内切酶）结构缺陷 t 切开（核酸内切酶）t切除（核酸外切酶）t修复（DNA聚合酶I）t连接（DNA连接酶）4、重组修复（复制后修复）复制时跳过损伤部位t遗传信息有缺损的子代DNA通过遗传重组而加以弥补t DNA聚合酶I和 DNA连接酶聚合连接母链的空缺在重组修复过程中，DNA链的损伤并未除去。5、应急反应（SOS和易错修复应急反应是由Rec A和lex A相互作用引起的，包括诱导 DNA损伤修复、诱变效应、细胞分裂的抑 制以及溶原性细菌释放噬菌体等。SOS反应诱导的修复系统包括避免差错的修复（切除修复和重组修复）和易错修复。SOS诱导产生DNA聚合酶和V,它们不具备 3 xt 5 /核酸外切酶校正功能，能在损伤部位 继续复制而导致错误倾向的复制。引起SOS勺作用剂通常具有致癌作用。（三）DNA的重组1、同源重组同源重组是最基本的重组方式，它通过链的断裂和再连接，在两DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。（ 1）Holliday 模型Holliday 模型可以较好说明同源重组过程。其基本过程是在两同源DNA分子间对应部位单链断裂、交换连接、分支移动及切开修复。实际上同源重组是由一个DNA分子的两条链断裂启动的，它们分别与另一 DNA同源区配对，再发生链的交换连接。（2）细菌的基因转移与重组 细菌可以通过接合、转化、转导和细胞融合四种方式发生基因转移。接合作用是指细菌的细胞相互 接触时遗传信息由一个细胞转移到另一个细胞的作用。接合作用有关蛋白质由接合质粒上各转移基因编码。DNA的一条链发生转移，随后再合成互补链。DNA的转化是指细菌品系吸收了外源DNA（转化因子）而发生遗传性状改变的现象，由多个基因编码的蛋白质参与作用，一条链或双链发生转移。转导是通过噬菌 体将细菌基因从供体转移到受体细胞的过程，分为普遍性转导和局限性转导。在某些因素的作用下细菌细 胞可以发生融合。外源基因经过上述过程进入宿主细胞后，即可与宿主基因发生同源重组。（ 3）重组有关的酶细菌参与DNA同源重组的酶至少有数十种，许多酶和辅助因子与DNA复制和修复是共用的。最关键的是Rec A蛋白，它能诱发 SOS反应和促进 DNA单链同化。Rec BCD酶是产生参与重组的 DNA单链的主要 途径。 Ruv B 是一种解螺旋酶，在 Ruv A 的帮助下推动分支移动，促进异源双链的形成。 Ruv C 可切开同 源重组的中间体。2、特异位点重组特异位点重组发生在特定位点内，并有特异的酶参与。如果重组位点反向存在于同一DNA分子内，重组产生倒位；重组位点正向存在于同一DNA分子内，重组发生切除；存在于不同分子内， 重组发生整合。入噬菌体DNA的整合和切除是一种特异位点重组。噬菌体的重组位点att P与大肠杆菌的重组位点att B之间有15 bp核心序列相同。在整合酶（Int ）、整合宿主因子（IHF）作用下发生整合；切除还需 Xis蛋白参与作用。沙门氏杆菌鞭毛相变由基因组H片段倒位所决定。H片段的重组位点hix为14 bp的反向重复序列，倒位酶Hin在辅助因子Fis帮助下使H片段发生倒位。免疫球蛋白基因在淋巴细胞发育过程发生两次特异位点重组。3、转座重组（ 1 ）细菌的转座因子转座子是一段可以发生转座的DNA片段。细菌的转座因子包括插入序列（IS ）、组合型和复合型转座子。转座因子含有编码转座酶的基因，两端为反向重复，两侧为正向重复。插入序列不含标记基因，只 能根据其对靶位点基因插入失活或检测序列来判断它的存在。组合型转座子由两个插入序列中间夹一个标 记基因所组成。复合型转座子不含插入序列但有转座酶基因、解离酶基因和标记基因。转座过程可分为非 复制转座和复制转座，借助转座酶将转座子两末端切开单链，并将靶