人类生育能力的保存与修复的研究进展 作者：邹宝林 袁水桥 于化洲 周玉言 孙绪磊 王冰松 李强【关键词】 生育能力 保存 修复 研究 30多年前人类体外受精技术（IVF）的成功为人类生育能力的修复提供了一种生物学模式的治疗手段，同时也开创了人类辅助生殖技术的新纪元。而在整个辅助生育过程中，配子、胚胎以及生殖器官的保存则是不可或缺的一环。随着低温生物学的发展，人类配子和胚胎已完全可以在体外长期保存而不影响其发育潜能，但大部分经过化疗和放疗的癌症患者的生育能力的保存问题仍为我们广大辅助生殖工作者所关注。虽然配子的体外发育和成熟培养的系统研究还处于初级阶段，但雌雄配子或性腺组织的冷冻贮存技术仍在不断发展。这些新型辅助生殖技术的安全性也是值得关注的问题。 1 男性生育能力的保存和修复 1.1 精液的冷冻保存 人类精液的冷冻保存技术具有良好的发展基础，并被常规应用于供精IVF中。但是，冷冻保存损伤了原精液中的大部分精子（接近50%），且降低了精子的活动力，也就需要比新鲜精液用量更多的冷冻-解冻精液才能成功完成受精（Holt，2000）。因此，精液的冷冻保存对于那些精子含量少且精液质量差的患者来说，就不是那么理想了，尽管卵胞浆内单精子显微注射（ICSI）的发展在很大程度上缓解了这一问题。最近的研究结果显示，从附睾和睾丸中取出的精子经冷冻-解冻后进行ICSI，获得了相似的受精率（接近60%）和妊娠率1。从睾丸活检组织中获得的人类精细胞进行冷冻保存，然后解冻并用于ICSI，结果诞生了一个健康的婴儿2。 1.2 人类精子的体外成熟和移植 化疗或放疗可以导致长期或永久性的无精子症。现在，那些接受放化疗的男性可以通过冷冻保存将他们的精子储存起来。而对于需要癌症治疗的未达到性成熟男孩，将其睾丸的活体组织冷冻保存起来可能就是唯一保存其生育能力的方法3。待到他们痊愈以后，将自体生殖细胞移植回成熟的睾丸中，进而有望再造生精能力，这将是癌症患者治疗后保存其生育能力的有效治疗方法。目前已成功地将异种小鼠睾丸细胞移植到遗传性不育的小鼠体内，而且，使来自某一物种的睾丸精子在另一个物种的睾丸中成熟也已实现4。小鼠的生殖细胞经过体外培养和冷冻保存之后的移植也获得了成功。 1.3 卵胞浆内单精子显微注射（ICSI） 在IVF过程中，可用精子的数量少会造成受精失败。在这种情况下，可以将单个精子注射到成熟的M期卵母细胞的细胞质中，促使其受精融合，这种方法通常被称为卵胞浆内单精子显微注射（ISCI）。第一例ICSI成功受孕是在20世纪90年代初5。此后，这项技术成为严重男性不育患者所广泛接受的治疗方法。如果精液中没有精子，可以从附睾中抽取（附睾精子显微抽吸术，MESA）或直接从睾丸中抽取（睾丸精子抽取术，TESE）。与ICSI相结合，MESA和TESE可以使阻塞性无精子症和非阻塞性无精子症（先天性输精管缺失或精子成熟障碍）的男性拥有自己的孩子6。使用从精液、附睾和睾丸中获得的精子进行ICSI，其受精率（接近60%）、卵裂和妊娠率（接近20%）都很相近，没有明显差别6。在精子不能达到成熟的情况下，注射未成熟的精细胞或精母细胞也能发生妊娠7。使用未成熟的精细胞进行ICSI的成功率很低，导致这一结果的原因可能在于，已经凋亡和DNA损毁的生殖细胞在患有严重睾丸衰竭的男性生殖细胞中所占比例过大7。生殖细胞的体外成熟可以帮助选择未受损的细胞进行ICSI，并且对于成功受精也是十分必要的。 1.4 ICSI的风险 尽管目前ICSI作为男性不育的治疗手段已被广泛应用，但仍需考虑其安全性和对后代的长期影响。ICSI是直接以人类实验为基础发展起来的。用其他物种如猕猴做的基础性研究，直到现在还在进行当中，而且行ICSI后的细胞核重组异常和精子染色体不凝聚现象已经凸显出来。ICSI绕过了许多受精过程中的潜在控制点（如精卵接触并穿过透明带以及精子与卵膜的融合）使得活动力差或形态异常的精子也能完成受精。行ICSI以后，性染色体的畸变频率会稍有提高8。原因是这一操作过程可能扰乱了卵母细胞的减数分裂纺锤体或精子染色体的凝聚，导致染色体不发生分离。不育男性染色体组型异常的较高发生率引起了对男性不育传递的危险性的关注。此外，还应该对使用ICSI技术诞生的孩子产后发育迟缓的事实进行讨论和关注8。随着使用未成熟精子、精细胞和精母细胞进行ICSI的病例不断增加，以及2例先天性畸形的报道9，使得对生精过程中基因表达和基因组印刻进行深入研究的重要性与日俱增。 2 女性生育能力的保存和修复 2.1 胚胎的冷冻保存 IVF多胎妊娠发生率的升高使很多生殖中心都对移植胚胎的数量进行了限制。胚胎的冷冻保存使IVF后获得的多余的胚胎被保留下来，在以后的周期解冻并移植，活产率约为12%。另一方面，年轻癌症患者的发生率显著增高，这就使保存他们的生育能力成为一种需求10。虽然患者可以在实施癌症治疗之前先将胚胎保存起来，但这需要将近6周的有潜在危险的治疗延迟期。而且在一些情况下，胚胎冷冻保存是不可行的，例如儿童患者不适用，未婚的年轻女患者则可能无法接受。对于这些女性，可采取的替代方法为卵母细胞或卵巢组织的冷冻保存。 2.2 卵母细胞的冷冻保存 Chen11曾报道了成熟卵母细胞经冷冻保存后的第一例成功受孕。但是，这种方法的成功率仍然很低。解冻后的卵母细胞活力降低，且经冷冻保存的卵母细胞由于颗粒细胞层过早脱落而出现了透明带硬化12。虽然透明带硬化可以通过ICSI或透明带钻孔予以弥补，但令人担忧的是冷冻-解冻后的卵母细胞的非整倍性有明显增加。成熟卵母细胞停滞在第二次减数分裂的中期（M），而且非整倍性也有所增加，这可能是减数分裂纺锤体的解聚和重组以及相关染色体在冷却和预热过程中丢失的结果。另一种保存卵母细胞的替代方案是冷冻未成熟的卵母细胞，在卵母细胞再次减数分裂以前，即处于胚泡（GV）期时，将它们冷冻保存起来。在此时期，染色体仍被包裹在核膜里，不易发生染色体丢失。但这样的卵母细胞在解冻后需要进行体外成熟。人类GV卵母细胞不能很好地适应冷冻保存，解冻存活的卵母细胞不到40%，且在这些存活的卵母细胞中，能达到体外成熟（M）的也不超过20%，囊胚的形成率也就更低了13。对于包裹着大量致密的卵丘细胞的GV期卵母细胞，很难找到最合适的冷冻保存方法，这可能就是造成上述结果的原因。 2.3 卵巢组织的冷冻保存和移植 对卵巢组织的冷冻保存研究始于20世纪50年代，将大鼠的卵巢经冷冻-解冻后，再自体移植到去卵巢大鼠的皮下部位，以恢复其原有的内分泌功能14。后来对绵羊（其卵巢形态与人类的相似）的研究重新引起了对常位自体移植作为恢复自然生育能力的方法的关注。由于卵巢体积过大而不能将其整体冷冻，所以只能以薄片或小块的形式保存卵巢的皮质组织。生长在卵巢皮质部的主要是原始卵泡，与充分长大的卵母细胞相比，它们的一些特性可使它们免遭低温损害。原始卵泡中的卵母细胞很小，停滞在第一次减数分裂前期，没有透明带和外周的颗粒细胞，并且只含有少量的低温敏感脂类。一项组织学研究对冷冻-解冻的人类卵巢皮质进行活组织检查，结果显示其中的卵泡形态正常15。尽管冷冻保存的卵巢组织经过解冻后，可以使大部分的（将近70%）原始卵泡得以复苏16，但是以目前的培养水平，还不能维持原始卵泡在体外继续生长到能够受精的成熟状态。不过，将卵巢皮质组织植入免疫缺陷鼠的肾囊膜下，使卵泡发育到了有腔卵泡的阶段的实验获得成功，则为冷冻-解冻的人类卵巢组织的长期培养提供了示范性的启迪。理论上讲，这些卵母细胞将被抽出，进行体外成熟然后受精。尽管这种方法可以在保护濒危物种、转基因动物和珍稀品种方面得到成功应用，但若用于治疗人类的不孕不育，则会引发伦理道德上的问题。 2.4 人类卵泡和卵母细胞的体外发育 IVF前的卵母细胞体外成熟技术可以避免组织移植手术，而且可以减少女性在进行超数排卵时对外源性促性腺激素的接触（可能引发卵巢过度刺激综合征），这项技术主要用于常规IVF。供卵也涉及激素刺激和取卵，使供卵过程对于捐献者来说很难完成，因此造成供卵短缺。如果捐献的是卵巢组织而不是卵母细胞，可能会有更多的女性愿意加入。重要的是，人类卵泡的体外生长（IVG）将会为早期卵泡发生机制的研究提供难得的机会。目前，人类卵泡的体外成熟技术正处于研究当中，并且总体上借鉴了那些成功应用于其他物种的方法。腔前卵泡通过酶分离和机械分离17后，进行几周的培养，一些卵泡就开始形成卵泡腔。来自胎儿卵巢的原始卵泡经长期培养，可达到卵泡长大，卵母细胞成熟，甚至发生第一极体的排出。简要地说，来自成人卵巢的原始卵泡最初还能在体外生长，但都活不过24 h，而且卵母细胞损失率一直很高17。 2.5 人类卵母细胞的体外成熟 第一例未成熟卵培养（IVM）婴儿成功诞生于1983年18。类似的几个报道相继而来，包括自然周期或部分诱导周期妇女和多囊卵巢患者，经卵母细胞IVM技术成功受孕且分娩19。当卵母细胞被从小型有腔卵泡中取出并进入体外培养，近60%的卵母细胞将会在48 h内达到核成熟。与精子接触后，又有约40%的卵母细胞能正常受精，出现两个原核并排出第二极体。20%25%的受精卵出现卵裂，但这些胚胎移植后的妊娠率却没有体内成熟的卵母细胞形成的胚胎高，大多数胚胎都在4-细胞和8-细胞之间停止了发育。但是，Chian等20近来的报道认为IVM后形成的胚胎也能获得相似的妊娠率。一些因素可能会对IVM卵母细胞的受精、卵裂、囊胚形成及妊娠率造成影响，包括体内或体外的激素环境和培养基的成分。对这些领域的进一步研究，将会使人们更深入地了解卵母细胞成熟机制，进而带来移植率和妊娠率的提高。 3 小结保存男女生育能力的新方法正在研究当中，并很可能在未来的十年内应用于临床。IVF和胚胎移植的妊娠率的持续走低似乎不可能使其达到自然受胎率的水平。但是，发展更好的胚胎筛选技术仍为达到自然受孕率带来了最大希望，在更准确地判断和选择有活力且遗传正常的胚胎的同时，减少多胎妊娠带来的生理、心理和经济上的负担。解决人类不孕不育的新技术正在不断的发展，但在过去的十年中，这些技术在没有足够的动物研究做基础的情况下，就被盲目地用于临床实践，并试图取得妊娠和活产的成功。年龄最大的IVF孩子才二十几岁，最大的冷冻胚胎孩子才十几岁，而最大的ICSI孩子还不到十岁。无法预知诸如ICSI的新技术是否会在未来几年里对患者生育能力和人体健康造成不良影响，或许更重要的是，我们目前正热衷的辅助生殖技术是否会对后代的生育能力及身体健康造成不良影响。【参考文献】 1 Habermann HR，Cieslak J，Niederberger C，et al.In vitro fertilization outcomes after intracytoplasmic sperm injection with fresh or frozen-thawed testicular spermatozoa.Fertility and Sterility，2006，73： 955-960.2 Gianaroli L，Selman HA，Magli MC，et al.Birth of a healthy infant after conception with round spermatids isolated from cryopreserved testicular tissue.Fertility and Sterility，1999，72： 539- 541.3 Hovatta O.Cryopreservation of testicular tissue in young cancer patients.Human Reproduction Update，2006，7： 378-38