免疫共沉淀技术免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用 为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内 生理性相互作用的有效方法。其基本原理是:细胞裂解液中加入抗体，与抗原形 成特异免疫复合物，经过洗脱，收集免疫复合物，然后进行SDS-PAGE及Western blotting分析。但这种方法有两个缺陷：一是两种蛋白质的结合可能不是直接 结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；二是必须在实验前预测目的蛋白是什 么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本 身具有冒险性。免疫沉淀反应(Immunoprecipitation)主要用于抗原或者抗体的定性检测。 其原理是指可溶性抗原与相应抗体在有电解质存在的情况下，按适当比例所形成 的可见沉淀物现象。据此现象设计的沉淀实验主要包括絮状沉淀试验，环状沉淀 试验和凝胶内的沉淀试验。凝胶内的沉淀试验依所用的实验方法又可分为免疫扩 散实验和免疫电泳技术2类。ImmunoprecipitationM bindingwashelutionCo-immunoprecipitationbindingwashelution免疫共沉淀技术路线准备工作：预冷PBS, RIPA Buffer,细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；2. 加入预冷的RIPA Buffer（1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶，0.5ml/5x106 个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶）3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4C，缓慢 晃动15min （EP管插冰上，置水平摇床上）4. 4C，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中5. 准备Protein A agarose，用PBS洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪 尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠6. 每1ml总蛋白中加入100l Proteii琼脂旨糖珠（50%）， 4C摇晃10min （EP管插冰上， 置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景7. 4C，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A珠子8. （Bradford法）做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1： 10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20C保存一个月）9. 用PBS将总蛋白稀释到约1哽仰，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞 中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10 gg/gl）10. 加入一定体积的兔抗到500gl总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的 多少而异11. 4C缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵 育12. 加入100gl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4C缓慢摇动抗原抗体混合物过 夜或室温1h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2 gl“过渡抗体”（兔抗鼠IgG，兔抗鸡IgG）13. 14000rpm瞬时离心5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPA buffer 洗3遍，800gl/遍，RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以 使用PBS14. 用60gl 2x上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上 样多少的需要而定（60 gl足够上三道）15. 将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖 珠，上清也可以暂时冻-20C，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min变性。RIPA Buffer 配制：基础成分：Tris-HCl （缓冲液成分，防止蛋白变性）NaCl （盐份，防止非特异蛋白聚集）NP-40 （非离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液）去氧胆酸钠（离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液；避光保存）注意：准备激酶（致活酶）实验时，不要加去氧胆酸钠，因为离子型去污剂能够使酶变性， 导致活性丧失。RIPA蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（PMSF）（用异丙醇配制成200mM的储存液，室温保存）EDTA （钙螯合剂；用H2O配制成100mM的储存液，PH 7.4）亮抑酶肽（Leupeptin）（用H2O配制成1mg/ml的储存液，分装，-20C保存）抑蛋白酶肽（Aprotinin）（用H2O配制成1mg/ml的储存液，分装，-20C保存）胃蛋白酶抑制剂（Pepstatin）（用甲醇配制成1mg/ml的储存液，分装，-20C保存）RIPA磷酸（酯）酶抑制剂激活的 Na3VO4 （用 H2O 配制成 200mM 的储存液，见 Sodium Orthovanadate Activation Protoco）NaF （200mM的储存液，室温保存）注意：在准备做磷酸（酯）酶实验的时候，不加磷酸酯酶抑制剂工作液配制：配制 100ml 的 modified RIPA buffe：1. 称取790mg的Tris-Base，加到75ml去离子水中，加入900mg的NaCl，搅拌，直到全 部溶解，用HCl调节PH值到7.42. 加 10 ml 10%的 NP-403. 加2.5 ml 10%的去氧胆酸钠，搅拌，直到溶液澄清4. 加1 ml 100mM的EDTA，用量筒定容到100ml，2-8C保存5. 理论上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入（抑蛋白酶肽，亮抑酶肽,胃 蛋白酶抑制剂各100此PMSF, Na3VO4, NaF各500 gl），但是PMSF在水溶液中很不稳定， 30分钟就会降解一半，所以PMSF应该在使用前现加，其他抑制剂成分可以在水溶液中稳 定5天。各种成分在工作液中的终浓度：Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4NP-40: 1%去氧胆酸钠：0.25%NaCl: 150 mMEDTA: 1 mMPMSF: 1 mM抑蛋白酶肽，亮抑酶肽肩蛋白酶抑制剂：各1 gg/mlNa3VO4: 1 mMNaF: 1 mM