先天性小耳畸形候选致病基因的筛选郝少娟;金蕾;李辰龙;王慧君;郑枫芸;马端;张天宇 【摘要】目的应用Affymetrix SNP 6.0芯片技术筛选先天性小耳畸形的候选致 病基因.方法对3例小耳畸形患者血液基因组进行Affymetrix SNP 6.0芯片分析， 采用Birdseed软件分析样本的芯片数据，通过Minor Allele Frequency对在患者 和汉族人参考样本中有显著差异的单核苷酸多态性(SNP)进行筛选.结果得到SNP 相关基因4180个根据已知文献收集和耳部发育相关并被SNP 6.0注释的基因共 5 个包括 MSX1,MSX2,GSC,HOXA2 和 PRKRA.结论应用 Affymetrix SNP 6.0 芯 片技术筛选出5个先天性小耳畸形的候选致病基因,分别是 MSX1,MSX2,GSC,HOXA2 和 PRKRA.%Objective To screen the candidate genes for congenital microtia by using Affymetrix SNP 6.0. Methods Genome-wide scan in 3 patients of microtia was performed by using Affymetrix SNP 6.0 array.The data were analyzed by using Birdseed software , and SNPs were selected through Minor Allele Frequency .Results A total of 4180 genes associated to the SNPs were acquired , and 5 of the genes played an important role in the development of ear according to the literatures , including MSX1,MSX2,GSC,HOXA2 and PRKRA.Conclusions Five candidate genes have been identified by using Affymetrix SNP 6.0, including MSX1,MSX2,GSC,HOXA2 and PRKRA.【期刊名称】中国眼耳鼻喉科杂志 【年(勤期】2017(017)002 【总页数】3页(P113-115)【关键词】先天性小耳畸形;芯片;GSC;HOXA2;PRKRA;MSX1;MSX2【作者】郝少娟;金蕾;李辰龙;王慧君;郑枫芸;马端涨天宇【作者单位】郑州大学第一附属医院耳鼻喉科郑州450000;上海市儿童医院耳鼻 喉科上海200062;复旦大学附属眼耳鼻喉科医院耳鼻喉科上海200031;复旦大学 附属眼耳鼻喉科医院耳鼻喉科上海200031;复旦大学附属眼耳鼻喉科医院耳鼻喉 科上海200031;复旦大学上海医学院分子遗传研究室上海200032;复旦大学附属 眼耳鼻喉科医院耳鼻喉科上海200031【正文语种】中文先天性发育不良是一类由于发育相关基因改变或者基因表达调控机制异常而导致的 疾病，是遗传因素和环境因素共同作用的结果。先天性小耳畸形是发病率仅次于唇 腭裂的颌面部发育异常，目前认为是由多个基因和环境因素共同作用而弓I起的复杂 遗传病。由于先天性小耳畸形的表型多样性和遗传异质性，使得定位和克隆先天性 小耳畸形致病基因十分困难。随着基因分型技术的成熟、单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism , SNP)数据库的迅速发展以及人类基因组单倍体图谱 的构建和不断升级，应用全基因组关联分析寻找先天性发育异常疾病的遗传学病因 已经成为生命科学的研究热点。候选基因关联性研究可以从基因的分子水平和动物水平分别进行探索，但是基因多 态性的研究效率相对较低，故需要应用芯片技术进行高通量分析。全基因组关联研 究就是通过大量样本的征集并对其进行全基因组水平上的基因分型，从基因分型结 果中挑选出与疾病性状相关联的序列变异。由于高通量SNP分型技术的发展，使 应用全基因组关联分析鉴定复杂遗传病的相关基因成为可能，已被证明是一种有效 的研究手段1-2，并且已经应用到糖尿病、精神分裂症、冠心病等疾病候选致病基因的筛选研究中。基于此前提，本研究利用Affymetrix SNP 6.0芯片对先天性 小耳畸形候选致病基因和易感位点进行筛查。1.1材料本研究在通过医院伦理委员会的审查批准后进行。所有患者均自愿参加 研究，签署知情同意书后进行详细的病例信息登记。患者智力、眼、心、脑、肾和 四肢等其他系统无明显异常。进行Affymetrix SNP 6.0芯片检测的3例患者临床 信息见表1。1.2方法抽取患者外周静脉血约5 mL于EDTA抗凝管中，来回颠倒数次后分装至 2 mL的EP管中，其中一管分装400 pL保存于-20 C冰箱备用，余样本于-80 C 冰箱长期保存。按照标准步骤抽提血液基因组DNA，采用Thermo Nanodrop DNA纯度浓度测量仪测定DNA纯度和浓度，确保OD260/OD280在1.7 1.9 之间，浓度50 ng/pL。由于Affymetrix SNP 6.0芯片技术对双链DNA质量要 求较高，因此用琼脂糖凝胶电泳和紫外线凝胶成像系统检测DNA是否发生降解。合格的样本进行Affymetrix SNP 6.0芯片检测差异性SNP，由北京博奥生物有限 公司生物检测实验室完成。采用Birdseed软件分析样本的芯片数据，得到每个样本中所有SNP探针的分型 信息。通过Minor Allele Frequency对在患者和汉族人参考样本中有显著差异的 SNP进行筛选，如果一个探针在2个以上样本中没有信号值，或在汉族人群中分 型频率未知，不做计算。经过此处理，最后得到大约783 746个SNP探针。这些探针上下游相对应的基因 有25 018个，计算每个SNP探针相对应的在各个样本中Minor Allele的频率值， 并将其与汉族人群中的频率值进行比较得到一个差异值。取P值显著性水平为1% , 得到两尾区间显著的SNP约19 365个，这些SNP相关的基因有4 180个。根据 已知文献收集和耳部发育相关并被SNP 6.0注释的基因共5个，包括MSX1, MSX2 , GSC , HOXA2 和 PRKRA。先天性小耳畸形的遗传特点不符合孟德尔遗传规律，故对其遗传分析和致病基因的 定位存在一定难度。现认为参与先天性小耳畸形发生的基因可能有多个，对多个微 显性SNP的筛选需要高通量芯片的支持。目前芯片技术种类繁多，可以满足不同 研究层面的需求，包括SNP芯片、DNA甲基化芯片、miRNA表达谱芯片等，广 泛应用于关联研究、连锁分析、拷贝数变异分析、基因表达和表观遗传学等研究领 域，成为筛选疾病候选致病基因和探索疾病发生机制的重要手段。基于SNP芯片 技术的全基因组关联分析是目前研究复杂疾病遗传学的主要手段3-5。本研究采 用的Affymetrix SNP 6.0芯片覆盖位点包括906 600个SNP探针，同时还包含 946 000 个拷贝数变异(copy number variation，CNV)探针。SNP 和 CNV 2 种 探针紧密均匀地分布在整个基因组，与其他同类芯片相比在性能、准确性和检测范 围方面都有提高，这给疾病易感性高通量研究带来极大的方便。通过对3例先天性小耳畸形患者血液基因组进行Affymetrix SNP 6.0芯片扫描分 析后获得5个候选致病基因，分别是MSX1，MSX2，GSC，HOXA2和PRKRA。 MSX1, MSX2属于同源核转录因子，两者在迁移前后的神经嵴细胞(neural crest cell，NCC)、咽弓和中鼻突间充质细胞中都有表达6，影响脊椎动物颅面部各器 官的发育7。小鼠模型结果显示MSX1和MSX2表达异常导致小鼠第一腮弓分化 区域畸形8-9。GSC基因表达在胚胎发育过程中具有时相性，并对NCC的迁移 有很重要的作用10。小鼠模型实验证明，GSC的缺失或突变可以导致颌面部复 合畸形，如中外耳发育缺陷和下颌骨发育不良11；先天性小耳畸形家系研究发现， HOXA2功能异常或缺失可以引起听觉系统结构畸形，可以累及中外耳甚至内耳12。HOXA2基因敲除小鼠表现为宽大的腭裂和中外耳发育畸形，并且由于无法 进行正常喂养多数在出生后24 h内死亡13-15。PRKRA基因含有多个重要的功 能区，参与了细胞周期阻滞、mRNA前体剪接和加工等重要的生理过程16。小 鼠PRKRA基因单拷贝破坏后发现小鼠体积减小，明显的小耳畸形和中耳发育异常17。由此我们认为，此5个基因与耳部发育密切相关，它们的改变可能引起先天 性小耳畸形的发生。在基因组水平，由单个核苷酸变化引起的DNA序列多态性被称为SNP。SNP通 常只涉及单个碱基的改变，可以由于转换或颠换引起，也可由于插入或缺失所致。 基因组DNA中任何碱基均有可能发生变异，而位于编码区内的SNP比较少，但 它们在遗传病研究中却具有重要意义。本研究对芯片筛查的候选致病基因所有编码 区进行扩大样本测序验证，以期发现先天性小耳畸形的相关致病突变。应用Affymetrix SNP 6.0芯片技术对3例先天性小耳畸形患者基因组进行扫描并 分析，筛选出5个先天性小耳畸形的候选致病基因MSX1，MSX2，GSC， HOXA2和PRKRA。这5个基因的何种方式改变导致了先天性小耳畸形的发生仍 需进一步扩大样本检测验证。1 Xu X, Knight J, Brookes K, et al. DNA pooling analysis of 21 norepinephrine transporter gene SNPs with attention deficit hyperactivity disorder: no evidence for associationJ. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet, 2005,134B(1):115-118.2 HUGO Pan-Asian SNP Consortium, Abdulla MA, Ahmed I, et al.Mapping human genetic diversity in AsiaJ. Science, 2009,326(5959):1541- 1545.3 Australia and New Zealand, Multiple Slerosis Genetics Corsortium (ANZ gene), Genome-wide association study identifies new multiple sclerosis susceptibility loci on chromosomes 12 and 20J. Nat Genet, 2009,41(7):824-828.4 Barrett JC, Clayton D, Concannon P, et al. Genome-wide association study and meta-analysis finds over 40 loci affect risk of type 1 diabetesJ.Nat Genet, 2009,41(6):703-707.5 Barrett JC, Hansoul S, Nicolae DL, et al. Genome-wide association defines more than 30 distinct susceptibility loc