本科生毕业论文（设计）题 目:谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）对灵芝生长发育中的活性氧物质（ROS）的改变及理化性的质影响 姓 名:于南学 院:生命科学学院专 业:生物科学班 级:生物科学101班学 号:13210101指导教师: 师亮 职称: 讲师2013年5月20日南京农业大学教务处制目录摘要3关键词3Abstract3Key words3引言31 材料与方法411 材料4111 菌种4112 CYM培养基4113 PDA固体培养基4114 试剂4115 主要仪器设备412 实验方法4121 ROS的测定4122 NBT测定4123 DAB染色5124 菌株对氧化物耐受性的检测5125 胞内Ca2+的荧光检测5126 三萜的测定5127 菌丝分叉检测52 结果与分析621 GPX沉默转化子胞内ROS含量上升622 NBT染色显示GPX沉默转化子胞内超氧根离子含量上升623 DAB染色显示GPX沉默转化子胞内H2O2含量下降724 GPX沉默转化子的菌株对氧化性物质的耐受力下降725 GPX沉默转化子胞内Ca2+的含量下降926 GPX沉默转化子菌株的三萜含量下降：1027 GPX沉默转化子菌丝的分叉数减少103 讨论12致谢12参考文献14谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）对灵芝生长发育中的活性氧物质（ROS）的改变及理化性的质影响生物科学101 于南指导教师 师亮摘要：谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶。ROS是需氧细胞在代谢过程中产生一系列活性氧簇,包括：O2-、H2O2 及HO2、OH- 等。生物体为了减少过氧化物质对机体的伤害，会通过GPX基因来调控体内过氧化物质的含量。本次试验就是通过GPXi（沉默）后测定真菌ROS信号通路中相关理化性质的改变例如：ROS的含量；ROS调控的钙离子浓度等变化；菌株耐氧能力的改变。关键词：GPXi；ROS；Ca2+；三萜；分叉The influence of Glutathione peroxidase (GPX) on reactive oxygen species (ROS) and the physical and chemical properties change during the growth and development of ganoderma lucidum Student Majoring in Biology Yu NanTutor Shi LiangAbstract：Glutathione peroxidase (GPX) an important peroxide decomposition enzyme that is widely exist in organic cells. ROS is a series reactive oxygen species in the process of metabolism, which produced by Aerobic cells, including: O2 -, H2O2 , HO2 and OH-. In order to reduce the body damage caused by peroxide material the organism adjusts the content of ROS by controlling Glutathione peroxidase (GPX). Our experiments test the change of the fungal ROS signal pathway and the change of physical and chemical properties by making the GPX gene silent, such as the content of ROS, Calcium ions concentration and the tolerant ability to oxidizing substances.Key words: GPXi; ROS; Ca2+ concentration; Ganoderic acids; bifurcation引言灵芝是非常珍贵的药用真菌，性微温，气特殊，味微苦涩。始载于汉代神农本草经，被认为能“益心气，安精魂，补肝益气，坚筋骨”，列为上品。本草纲目认为灵芝有“滋补强壮，延年益寿”“利关节，治耳聋”等功效。2000年出版的中华人民共和国药典收载灵芝（赤芝、紫芝）子实体为法定中药材，药典中规定的中药材是赤芝或紫芝的干燥子实体2。同年，灵芝作为10种中草药之一也被收载于美国出版的美国草药药典和治疗概要中，灵芝在国内和国际医药学界的地位可见一斑。灵芝在分类系统上是隶属于真菌门(Eumycota)，担子菌亚门(Basidiomycotina)，层担子菌纲(Hymenomycetes)，无隔担子菌亚纲(Holobasidiomycetidae)，非褶菌目(Aphyllophorales)，灵芝菌科(Ganodermataceae)，灵芝属(Eanoderma)3。灵芝中含有多种有效化学成分，包括灵芝多糖、三萜化合物、核苷化合物和生物碱类化合物等，其中三萜类化合物由于其广泛的药理活性已受到普遍关注，研究表明灵芝中三萜化合物具有抗癌、抗炎、抗氧化、抗HIV、抗组织胺释放、保肝护肝等作用4谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶。在动物细胞中GPX的活性中心是硒半胱氨酸，其活力大小可以反映机体硒水平。但在真菌细胞中关于GPX的这方面还不清楚。但可以确定的是它能使有毒的过氧化物ROS还原成无毒的羟基化合物，从而保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物的干扰及损害。ROS是需氧细胞在代谢过程中产生一系列活性氧簇,包括：O2-、H2O2 、HO2、OH-。 低浓度的ROS 可以促进转录因子的激活以及对细胞增殖、分化有积极作用。但是中、高浓度的ROS通过细胞氧化应激反应诱导细胞凋亡甚至导致其坏死。生物体为了减少ROS对机体的损害会利用多种物质将其分解，而谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）就是其中之一。而ROS对生物体的影响还不止于此。已有研究表明，ROS的积累可以影响Ca2+的含量5。研究发现，在动物细胞中ROS能够与钙信号通路进行互作，激活钙通道，增加钙离子向胞内的流入进而影响钙信号传递。其中，钙离子作为生物体内重要的第二信使参与多种生物学功能。但是此类调控机制在真菌是否依然适用却有待考证。但可以确定的是，Ca2+的含量可以影响三萜的含量6。此类调控在细菌、真菌、植物的抗逆及促进次级代谢产物积累方面都发挥了重要作用8-10。本课题从检测GPX沉默菌株中胞内ROS的含量和钙离子含量以及GPX沉默菌株对氧化性物质的耐受能力等几方面来研究GPX对ROS的影响。1 材料与方法11 材料111 菌种将南京农业大学生命科学院应用真菌实验室保藏的菌种G20，URA3，GPXi1(G1)， GPXi3(G3)，GPXi4(G4)，GPXi5(G5)，GPXi7(G7)，GPXi9(G9)，GPXi10(G10)，GPXi11(G11)。112 CYM培养基1麦芽糖，2的葡萄糖，0.2酵母提取物，0.2蛋白胨，0.05MgSO4.7H2O，0.46KH2PO4。113 PDA固体培养基去皮土豆200g（切块煮沸30min，8层纱布过滤取滤汁），葡萄糖20g，定容至1000mL，加入2%琼脂，高压灭菌30min后使用。114 试剂冰醋酸、高氯酸、香兰素、95%乙醇、无水乙醇、荧光增白剂、NBT、DBA。115 主要仪器设备分光光度计、烘箱、分析天平、天平、超声波清洗仪、摇床、28 恒温培养箱、无菌超净台、高压蒸汽灭菌锅、小型种子打碎机、恒温水浴锅等。12 实验方法121 ROS的测定将南京农业大学生命科学院应用真菌实验室保存菌种G20,，URA3，G1，G3，G4，G5，G7，G9，G10，G11接种到CYM固体培养基上。将盖玻片灭菌后斜插入菌丝生长的培养基中，待菌丝爬到盖玻片，在载坡片上滴上DCFH-DA染料菌丝染色20min，在荧光显微镜下观察并拍照。122 NBT测定取适量CYM液体培养基中培养好的菌丝球于培养皿中，在培养皿中加入适量的NBT染液轻轻摇匀使之充分浸没菌菌丝球。在光照下染色2h后观察不同菌种的菌菌丝球边缘染色情况并拍照比较。123 DAB染色将CYM液体培养基中培养好的菌丝球于培养皿中，在培养皿中加入适量的DAB染液轻轻摇匀使之充分浸没菌丝球。在光照下染色8h后观察不同菌种的菌落染色情况并拍照比较。124 菌株对氧化物耐受性的检测将每一种菌株分别接种到加入VK3和KO2的PDA平板上并设置一组对照，在培养箱中培养3-4天后取出。比较同一菌株的菌落在不同培养基上的形态差异并拍照记录。测量菌落的直径大小并记录。125 胞内Ca2+的荧光检测将南京农业大学生命科学院应用真菌实验室保存菌种G20，URA3，G1，G3，G4， G5，G7，G9，G10，G11接种到CYM固体培养基上。将盖玻片灭菌后斜插入菌丝生长的培养基中，待菌丝爬到盖玻片，将长有菌丝的盖玻片取下，载玻片中间地上Fluo-3AM染料，盖上盖玻片，分别在4C和37C下染色1h。置于荧光显微镜观察并拍照。126 三萜的测定（1）将CYM固体培养基上的菌株分别接种至对应的液体CYM培养基震荡培养7天，收集菌丝，置于60C烘箱过夜烘干至恒重，次日将其研磨成粉状装于1.5 mL离心管中。（2）精密称取烘干的样品0.2 g，用95%乙醇浸泡样品，并定容至10 mL，超声波破壁2 h，每20 min摇动一次，取1 mL于1.5mL离心管，于4000 rpm的离心机上离心10 min，取上清备用。（3）空白制备：精密吸取0.1 mL蒸馏水于10 mL具塞试管中。（4）样品的测定：精密吸取上清0.1 mL于10 mL具塞试管中，加香草醛0.2 mL，高氯酸0.5 mL，加盖振荡混匀，于60 C水浴中保温20 min，此时预热分光光度计，取出后迅速用冰水冷却（10 min）；之后加入5 mL冰醋酸，加盖振荡混匀，然后于550 nm处测吸光值。（5）计算公式：W = CV1/MV2 100%C （g）从标准曲线上查得样品分解液的三萜含量V1（mL）样品定容体积V2（mL）比色测定时所称取的浅样分解液体积M（g）样品质量W（%）灵芝三萜含量127 菌丝分叉检测将南京农业大学生命科学院应用真菌实验室保存菌种G20，URA3，G1，G3，G4， G5，G7，G9，G10，G11接种到CYM固体培养基上。将盖玻片灭菌后斜插入菌丝生长的培