细胞免疫荧光步骤【原理】用特异性抗体（第一抗体）与细胞中的相应抗原反应，洗去未与 抗原结合的抗体再用荧光标记的第二抗体与结合在抗原上第一 抗体结合，形成抗原-抗体-荧光抗体复合物由于荧光素在荧光显 微镜下经过特定波长的光照摄激发后能发射出荧光，借此可对抗 原定位和定量。【材料】培养细胞【试剂】4%的多聚甲醛。 PBS （0.18M PHM7.2）: NaCl 18 克，Na2HPO 4. 12H2O 12 克，NaH2PO4,2H20 0.8 克溶于 2000m 蒸馏水。 封闭血清：与二抗同种来源属性的非免疫血清。 第一抗体：XXX。 第二抗体：与一抗种属性匹配TRITC标记的，（中杉金桥公司，ZF-0313Goat Anti-Mouse IgG （H+L）,）。 DAPI ：（碧云天 公司，Cat. C1006）染核。 抗荧光淬灭封片剂： 碧云天公司 Cat .PO126【器材】 冰箱，载玻片，盖玻片（做正面标记），微量移液枪，移液枪枪头，吸管，湿盒，指甲油，DOCK笔，EP管， 吸水纸，六孔板，摇床，振荡器。【配制液体等】 0.5%-Triton : （ PBS 99.5ml +0.5mlTriton 由于 Triton 比较粘，配前先在室温放会儿,磁力搅拌器搅匀可分装储存） 10%正常封闭血清 ：（用PBS-Triton稀释，振 荡器上振荡充分混匀，临用前配制）。 0.3%-Tween；用 PBS 稀释Tween。【步骤】1取出生长48小时的细胞爬片，移入一个干净的六孔板冷PBS浸泡不超 过3分钟（事先在六孔板的第一排三个孔分别标记）。2每个玻片滴加4%的多聚甲醛冰上固定14分钟。注意，要水平，覆盖 均匀。（准备封闭血清用 PBS-Triton 稀释 1:10振荡器上振荡混 匀）。3 冷PBS,5分钟X2次 摇床150rpm缓慢洗净，PBS-Triton透膜5min。 （如果是胞浆，核或膜内表面表达需要这一步，如果是膜外表面表达的则不需要透膜）4 擦干爬片边缘，用DOCK笔在爬片四周边沿画圈（以防止爬片上所 加试剂因失去张力流失，导致干片）。将爬片分别放入六孔板下排与上排标 记相对应的孔内（该加封闭血清了，此时要求板是干燥的，下一排板没用 过是干燥的）。5 用微量移液枪，在每张爬片上加10%正常封闭血清，室温湿盒中 阻断30 min（准备一抗，用 PBS-Triton 稀释 抗体1:100振荡 器上振荡混匀）。6 一抗孵育：加巳经稀释好的一抗， 用微量移液枪小心加一抗，（逐 个片去封闭液，擦干圈外水，加一抗注意：不要碰细胞）置湿盒中，4冰 箱过夜，剩余的一抗保留。7 .次日，轻轻去盖，查看张力还在。轻轻移至室温，湿盒内再孵育1小时。 注意不干片。8 PBS-Tween洗，3次x5min （据情况适当变化），。9将爬片四周擦干，再将其分别放回六孔板上一排原先的孔内。（加二 抗，上一排板巳干，所以再移回上一排板中）。10.避光处，加二抗覆盖均匀 平放室温孵育一小时（由于试剂会挥发，此间要查看，适当补加二抗避免干片）。11避光处,，PBS-Tween洗3次X5min （据情况适当变化），轻轻的。12避光处，待爬片晾干，加DAPI （一小滴），室温孵育4min，PBS-Tween 洗3次，用手晃动洗涤。13避光处，待爬片晾干，往载玻片上滴加封片剂，爬片倒扣于封片剂上， 用指甲油封爬片四周（防封片剂溢出并固定爬片）。14观察：注意荧光强度随着灯光刺激衰减，尽快照相注意：为了避免互相污染 从第3步开始，三个爬片滴加试剂的吸管不 能混用。