植物源性重重组人血血清转铁铁蛋白的的多功能能性概述人血清转铁铁蛋白（htf）是人人血清中中主要的的结合铁铁蛋白质质，在铁转转运中有有重要作作用。另另外，htf还有许许多其他他的作用用，包括括抗菌功功能和对对哺乳动动物细胞胞增殖、分分化中的的生长因因子效用用。其多多功能性性使其在在不同疗疗法和商商业应用用中有巨巨大价值值。然而而，htf的这些些成功应应用很大大程度上上取决于于大量的的高质量量的htf的应用用。本研研究中，我我们将植植物作为为获得重重组htf的一种种新平台台。我们们的研究究表明转转基因植植物是一一种获得得rhttf的有效效系统，最最大积累累量达到到了全部部可溶蛋蛋白的0.225%（或高高达33.5ugg/g的叶子子鲜重）。此外，植物源性rhtf保持了许多与天然htf相同的生物活性。尤其是rhtf在体外可逆性的结合铁作用，表明了其抑菌活性、在无血清培养基中的支持细胞增值的作用，和在体外内化进入哺乳动物细胞的性质。本研究的成功使得未来多领域应用植物源性rhtf成为可能。植物源性rhtf突出的应用就是作为特定细胞的一种新的载体或者作为蛋白质/肽段药物的口服递送以治疗人类疾病例如糖尿病。为证明此假说，我们在植物中又额外地表达了一种包含胰高血糖素样肽段-1（GLP-1）或其衍生物的htf融合蛋白。在此，我们展示植物源性htf-GLP-1融合蛋白保持了体外培养基中内化进入哺乳动物细胞的能力。简介转铁蛋白TTf包含了了所有脊脊椎动物物体内发发现的一一系列同同源性的的铁结合合蛋白糖糖蛋白（Aisen and Harris, 1989），主要功能是铁的螯合和转运。Tf是一种单分子蛋白，分子量范围为76-81 kDa，取决于糖基化程度。每种TF蛋白包含两种相似的裂片，分别叫做N-末端和C-末端，每一裂片包含单一的铁结合位点（Aisen and Harris, 1989; Baker et al., 2002）。hTf是转铁蛋白Tf家族的主要成员。hTf蛋白由679个氨基酸组成，主要在肝脏合成并分泌入血（MacGillivray et al., 1983）。hTf的主要功能是络合血中的游离铁并将之转运到全身各处（MacGillivray et al., 1983）。放射示踪研究显示至少80%的络合至tHf的铁转运至骨髓并组成新生的红细胞（Finch and Huebers, 1982）。除其众所周知的铁转运功能外，hTf还有许多额外的功能，许多与其携铁能力无关。例如，研究显示HTF可促进体外无血清培养基条件下鼠粒性白细胞和巨噬细胞前体细胞的克隆生长（Iizuka and Murphy, 1986）。另外，HTF的存在对于大多数哺乳动物细胞的培养有重要作用，例如体外受精培养（Holst et al., 1990）和肝细胞群体的维护和扩展（Suzuki et al., 2006）。当增殖细胞高表达HTF受体以允许HTF包裹并可能引发和维持细胞DNA合成时，HTF常常作为一种生长因子（Gomme et al., 2005）。HTF的其他作用包括抵抗细菌、酵母菌、病毒和真菌的抗菌活性（(Artis et al., 1983; Salamah and al-Obaidi, 1995），降低细胞粘附的能力（Ardehali et al.,2002）。HTF的多功能性可以作为潜在的治疗和非治疗应用。例如，HTf已被用来治疗人类转铁蛋白缺乏症（一种以贫血、铁超载、生长迟缓和感染发生率增加为特点的状况）（Hayashi et al., 1993），局部贫血-再灌注损伤（促进氧化应激导致炎症、最终因凋亡和坏死而导致细胞死亡的一种情况）（Hayashi et al., 1993）和心血管疾病（Hayashi et al., 1993）。HTF的治疗送递也降低了放射疗法的副作用（Koterov et al., 2003），有助于为骨髓移植患者提供抗微生物活性的作用（von Bonsdorff et al., 2003）。此外，HTF已用来作为一种新的载体系统，在体内运载药物入癌细胞（Laske et al., 1997）。近来，HTF被证实作为一种高效的载体，以送服口服蛋白质和氨基酸药物入内脏以实现全身治疗效果（Widera et al.,2004; Bai et al., 2005）。HTF蛋白也有许多巨大的潜在非治疗应用。例如，许多无血清培养基以HTF作为血清代用品，支持哺乳动物细胞生长（Barnes and Sato, 1980a,b）。为了使HTF的这些商业和治疗应用具备可行性和得到实现，大量HTF的可靠、廉价的供应是很重要的，取决于一种高效、性价比合算的重组生产系统。迄今为止，已已有数种种表达系系统报道道获得重重组HTF。描述述的RHTTF的细菌菌表达，仅仅允许生生产蛋白白质的氨氨基末端端和羧基基末端领领域（半半分子）（Ikeda et al., 1992; Steinlein and Ikeda, 1993;de Smmit et al., 119955），随随着19HHTF分子内内二硫键键的出现现，使得得利用微微生物主主机获得得这种蛋蛋白成为为了一项项挑战。使使用细菌菌获得重重组的进进一步限限制，是是其从重重组蛋白白到获得得功能性性产品过过程中无无法去除除信号肽肽（MaacGiilliivraayet al., 119988）。作为为一个可可选择的的细菌生生产系统统，已证证实rhhTf在幼仓鼠肾肾（）细细胞的表表达（Funnk eet aal., 19990; Maasonnet al., 119911, 119933, 220011）。虽虽然成功功了，但但幼仓鼠鼠肾细胞胞系统受受限于低低产量的的rhTTf（no mmoree thhan 40 mg Lof celll ccultturee）。为为了降低低生产难难度，已已研究了了数个表表达系统统，包括括酵母菌菌（仅在在的末端领领域和两两个突变变类型表表达）（Steinlein et al., 1995;Sargent et al., 2006）、使用杆状病毒表达系统的昆虫细胞（ 20毫克L的细胞培养）（Ali et al.,1996）和果蝇细胞（不超过0.35毫克L的细胞培养）（Lim et al., 2004）。因为这些系统都是依靠昂贵的细胞培养和发酵方法，他们不适合低成本的规模化生产。此外，哺乳动物的细胞培养很容易受到细菌和病毒病原的污染，导致产品安全的担忧。植物生物反反应器已已被证实实作为一种种有效的的、有吸吸引力的的重组哺哺乳动物物蛋白的的生产平平台（Schhilllberrg eet aal., 20005; Daanieell, 20006;Boeehm, 20007）。作为为生物反反应器，植物允允许无限限的可扩扩展性，通过哺哺乳动物物病原体体消除产产品污染染，以及与微生物物或动物物相比，使用细细胞培养养系统降降低了生生产成本本（Dannielll,220066; BBoehhm, 20007; Ma et al., 220088）。因因为他们们的真核核特性，植植物可以以进行复杂杂的转译译后修改改和加工工，这是是许多转转基因哺哺乳动物物具有治治疗作用用的蛋白白质的生生物学和或免疫疫学功能所要要求的。此此外，可可食用的转基因因植物组组织提供供了允许许植物源源性治疗疗蛋白质质和多肽肽直接口口服递送送的可能性性，消除除了昂贵贵的下游游蛋白纯纯化和加加工。在本研究中中,我们已经经证实了了利用转转基因植植物作为为生产rhTTf新体系的可行性性。因为为天然hhTf是一种分泌泌分子，rhTTf是针对对转基因因植物内内膜系统统以提高高积累的。在在此，我我们证明明了转基基因烟草草植物是是一个有有效的生生产rhTTf表达系统统，最大限限度积累累可达0.25%的全部可溶溶性蛋白白质（）（或者高达33.5鲜叶组织）。转基因蛋白质的生化和功能特性表明了植物源性是非糖基化的，正如酶和化学去糖基化分析证实的，保留的多项与天然hTf性能相同的性能。尤其是，植物源性rhTf在体外可逆性地络合铁，证实了抑菌活性，在无血清培养中支持细胞生长和增殖，并保留了在体外内化进入哺乳动物细胞的能力。这些结果表明，植物源性rhTf可能存在许多潜在应用价值。最重要的功能是，使用rhTf作为特定细胞或口服递送的蛋白质和多肽药物的新载体分子。为了验证这个假说，我们在转基因植物中额外引入了一个rhTf融合蛋白，包含抗胰高血糖素样肽1 (GLP-1)或其衍生物。已证明，当加入到体外细胞培养基，植物源性rhTf-GLP-1融合蛋白有内化进入哺乳动物细胞的能力。该研究结果具有重要的影响，其中包括开发植物源性rhTf作为一种新的靶向给药系统的可能性，以及未来开发出基于新的植物源性rhTf治疗广谱疾病方法的可能性。结果转基因植物物的植物物表达载载体的构构建和产产生二进制植物物表达载载体的产生生，强本本构CaMMV 335S促促进剂促促进了hhTf的的表达天然然信号肽肽如图1表明。来来源于烟烟草蚀刻刻病毒（）的端输出序列和内质网（）保留信号主题整合入以最大限度积累（(Ma et al., 2005; Wang et al., 2008）。即时插入上游信号KDEL的6xHis标签整合到上，以通过固定化金属亲和层析促进下游的纯化（）。低生物碱烟烟草变种种（MMenaassaaet al., 220011）是利用用含有pRJJC-hhTF的的根癌农农杆菌转转变的。所所产生的的20多个独独立的转转基因烟烟草株，与与所有转转基因植植物，表表现出了了正常的的生长和和发育，与与非转变变烟草cv. 811V9相相比没有有表型方方差。hTff整合入入核基因因组，且且其在转转录水平平的表达，分分别经聚聚合酶链链反应（）和逆转录聚合酶链反应（）而得到证实（数据未显示）。转基因植物物的rhTTf蛋白质质积累rhTf在在转基因因植物的的积累，通通过及其后后的使用用市面可可得的抗hTf抗体的免免疫蛋白白印迹得得到印证证。总蛋蛋白萃取取物时从从植物获获得的，通通过获得rhTTf阳性表达达。如图图，抗抗抗体检检测到一个明明显的分分子质量量76的单单一蛋白白，与标标准等同同尺寸（Sigma-Aldrich）。不出所料，在相同的条件下的野生植物叶子提取物中没有检测到蛋白质带。烟叶提取物中rhTf的相对积累量的测定，采用间接的抗hTf抗体ELISA法与一个hTf标准比较。rhTf的积累水平，发现在独立主要转基因植物(T0plants)，范围从0.07%到0.25%（或6至33.5鲜叶重）。此外，转基因烟草植物的rhTf有明显的空间分布的差异，最上面的叶子表现出最高水平转基因蛋白质积累（数据未显示）。植物源性是非糖糖基化的的为了研究植植物源性性rhTTf的醣化作作用，重组蛋蛋白进行行了酶、化学去糖基化。对酶的去糖基化，总蛋白提取物以及通过His-purification 得到的植物源性rhTf的部分纯化样品，用PNGase F处理并通过使用抗hTf抗体的免疫印迹法分析。在PNGase F处理之前，纯化rhTf的完整性，通过Coomassie bule stainong考马斯亮蓝染色在SDS - PAGE上确认。hTf蛋白包含两个可能的糖基化位点羧基末端区域（Asn413 and Asn611）（Spik et al., 1975）。用PNGase F对糖基化hTf标准（Sigma-Aldrich）的消化作为