环境样品中环境样品中DNA的别离的别离纯化纯化和文库构建和文库构建制作：林存刚制作：林存刚专业：微生物专业：微生物学号：学号：2003028精选课件 基因文库基因文库 gene library：将一个基因组的DNA用限制酶切割成适当大小的片段，并进行克隆化，包括其中每一种片段的汇总，称为基因文库。为防止用一种限制酶可能切断某个基因，应该用不同限制酶切割建立基因文库。对于一个大的基因组，通常这种基因文库是由霰弹法克隆构建的。根据基因文库的组成，可分为基因组文库和cDNA文库等。基因文库可用于研究基因的结构功能和筛选基因工程的目的基因。精选课件 别离纯化和文库构建别离纯化和文库构建q从分子水平上研究微生物的意义q别离纯化q文库构建q研究进展qq精选课件 从分子水平上研究微生物的意义从分子水平上研究微生物的意义l传统微生物学开展l微生物资源开发利用l现代生物技术开展lBACK精选课件 分分 离离 纯纯 化化o样品采集和材料准备o别离和纯化oDNA浓度测定oBACK精选课件样品研磨冻融抽提热处理离心抽提去除抑制剂离心TE溶解电洗脱别离纯化酶切要求精选课件精选课件 浓度测定浓度测定粗制DNA浓度测定：DNA的酶切产物与待测DNA一起进行琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，比较荧光亮度，推测DNA的浓度。纯化DNA的浓度测定：利用DyNAQuant200荧光仪测定。返回精选课件文库构建和分析文库构建和分析v理论根底v实施方法v评估分析v精选课件 文文 库库 构构 建建EcoRI酶切位点富含A/T(或PstI的酶切位点富含G/C，可以用来酶切建库。载体和酶切片段都用同一种酶酶切后，才会具有互补位点，才能连接。噬菌体菌落更容易保存。精选课件 实实 施施 方方 法法vEcoRI或PstI对纯化DNA进行酶切v琼脂糖电泳别离酶切产物vDEAE纤维素滤纸回收38kbEcoRI或PstI酶切段v载体处理经EcoRI或PstI酶切和去磷酸化处理v连接v连接产物转化大肠杆菌病毒转染或氯化钙法v蓝白斑筛选重组子v培养保存v返回精选课件策略策略精选课件 实实 施施 方方 法法 精选课件 评评 估估 分分 析析l对阳性克隆插入片段进行单向测序l去载体局部处理l开放阅读框预测lBLAST同源性检索分析l推测开放阅读框可能编码的功能lBACK精选课件 开放阅读框开放阅读框 开开放放阅阅读读框框ORF,open ORF,open reading reading frameframe是是一一个个没没有有终终止止编编码码的的密密码码子子序序列列。在在原原核核基基因因中中，编编码码区区是是一一个个单单独独的的ORFORF；而而真真核核基基因因的的编编码码区区通通常常包包含含几几个个不不相相连连的的ORFORF被被非非编编码码序序列列即即内内含含子子所所分分隔隔。每每条条双双链链DNADNA有有6 6个个潜潜在在的的读读框框reading reading framesframes或或称称相相位位phasephase：一一条条链链沿沿5-35-3方方向向有有3 3个个读读框框forwardforward，称称为为正正向向读读框框；那那么么其其互互补补链链沿沿5-5-33方向的方向的3 3个读框称为反向读框个读框称为反向读框reversereverse。返回返回精选课件 BLAST软件软件BLAST对一条或多条序列,在一个或多个核酸或蛋白序库中进行比对。同时还能发现具有缺口的可能比对上的序列。共有五种：1.核酸序列到核酸库中的一种查询，库中存在的每条序列都将同所查序列作一对一地核酸序列比对。2.3.4.5.BACK精选课件精选课件精选课件 蓝蓝 白白 筛筛 选选精选课件 相关研究进展相关研究进展通过设计PCR引物直接从环境样品DNA中扩增得到蛋白类似物的基因。用分子克隆方法从环境样品中直接得到新酶。本实验方法适用于获得对分子操作敏感且能用来高效建库的基因DNA。可以获得相关的新的外源序列。从基因文库中获得完整基因。基于序列同源性或酶活性筛选方法寻找目的基因。精选课件 精选课件