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BPG300层析柱标准装柱流程规范 SOP-BPG-001操 作 标 准目的:为了使BPG300层析柱装柱过程可重复,并能够得到较好的柱效,故建立此操作规范。范围:配合KTA process系统进行有效的蛋白质纯化操作。责任人:层析工序操作人员标准操作程序:1 基本术语概念填料因子(Packing Factor, PF):指在在装柱过程中,用低流速(如60cm/h)对填料进行沉降压缩得到的调料高度和最后装柱完成时填料高度(柱高)的比值,GEHC生产的各种常见填料的PF参见GEHC AxiChrom 300-1000 columns User Manual 28-9562-89 Edition AA;线性流速(linear flow rate):单位时间内液体流经的直线距离,常用cm/h表示;体积流速(volume flow rate):单位时间内液体流经的空间容积,常用ml/min表示;换算:2 准备工作2.1 检查层析柱的完整性,所带配件,是否水平(用水平仪矫正),是否清洁(如有污染应进行清洗)。2.2 确定所用填料及其特性、浓度等以DEAE Sepharose Fast Flow填料为例,其填料因子(PF)为1.15,新填料(slurry)浓度为75%(保存于20%乙醇中),耐压3bar。2.3 确定放大后的工艺参数以XX生化制药股份有限公司的放大工艺为例,中试工艺参数:柱高h=10cm;体积流速v1=3ml/min;柱内径d=1.6cm.即,线性流速v2=v1/s柱=3/(3.140.82) cm/min=1.5 cm/min;样品与填料接触时间t=h/v2=10/1.5min=6.67min;在工艺的线性放大中h、v2和t均不变,则可保证样品出峰的位置(洗脱时间)和形状不变。使用BPG300层析柱进行放大的工艺参数:装柱体积V柱= S柱h=3.141.521L=7L;装柱需要slurry体积Vslurry=V柱PF/Cslurry以DEAE Sepharose Fast Flow为填料,则,Vslurry=71.15/0.75L=10.73L;装入柱中的slurry高度Lslurry=Vslurry/S柱=10.73/(3.141.52)dm=1.52dm=15.2cm.3管路安装3.1 层析柱管道和配件安装3.1.1卸下柱子顶部和底部的盲堵垫圈,旋松密封调节器,用纯水或20%乙醇充分浸润柱内壁和柱头O型圈;3.1.2 用扳手对称卸下支持杆连接到法兰的螺丝,并通过旋转高度调节手柄将柱头旋至最高处,在柱头顶部依次安装压力表和四路二通阀,在柱底安装四路二通阀;3.1.3在顶部四路二通阀上横向连接一根细管,另一端连至KTA process上端连接口COLUMN TOP,同时从柱底四路二通阀横向接出一根细管至KTA process的下端连接口COLUMN BOTTOM。 图1、BPG300层析柱安装示意图3.2层析柱下端筛网排气泡3.2.1连接两根足够长的细管到KTA process进样泵的A1和B1进口,两管另一端均放入纯水中;3.2.2从A1泵入纯水:打开UNICORN软件,在system control窗口点击manualvalvesInletA,选择inletA1,insert;InletB,选择closed,insert;Column,选择upflow,insert;PumpFlow,设定流速60L/h,点击execute运行程序充水至BPG柱中2-3cm左右,pause,清除下端筛网中的空气,用注射器吸出筛网中残留的气泡。4装填料4.1准备填料所用填料为DEAE Sepharose Fast Flow ,装置的是保存于20%乙醇中的新slurry;4.2卸下柱头,用搅拌棍引流加入混匀的slurry至15.2cm处,再加入纯水至40cm左右,充分搅拌混匀,同时避免挤压筛网和柱壁,静置使填料界面至少低于38cm;4.3在system control窗口点击manualvalvesInletA,选择inletA1,insert;InletB,选择closed,insert;Column,选择downflow,insert;PumpFlow,设定流速60L/h,点击execute运行程序将柱头上端筛网充满水以除去气泡,再装上柱头,用密封调节器固定柱头,拧紧螺丝;4.4在system control窗口点击manualPumpFlow,设定流速为42L/h(60cm/h),进行填料的沉降,待填料高度降至14cm左右,将密封调节器旋至全松,将柱头快速调至距离填料3-4cm处,将密封调节器旋至半松,将柱头快速调至滤网距离填料1-2cm,旋紧密封调节器,再设定高流速(如150L/h),继续压缩填料,最后再调节柱头至10cm。整个过程一直有流速,泵速不能停。5 柱效测定图2、柱效测定示意图5.1 平衡 将A1接口细管放入0.4M NaCl溶液中,将柱顶端四路二通阀调至管路与大气相连状态,在system control窗口点击manualvalvesInletA,选择inletA1,insert;InletB,选择closed,insert;Column,选择downflow,insert;PumpFlow,再设定高流速(如150L/h),点击execute运行,排气泡,再将阀调至管路与柱头相连状态,平衡3-5个柱体积至电导曲线稳定,点击END;5.2上样5.2.1将B1接口细管放入2M NaCl溶液,柱顶端四路二通阀调至管路与大气相连状态,在system control窗口点击manualvalvesInletA,选择Closed,insert;InletB,选择InletB1,insert;Column,选择downflow,insert;PumpFlow,设定高流速(150L/h)点击execute运行,排气泡,pause;5.2.2 在system control窗口点击manualOtherEnd_Timer,选择Acc. Volumn, Timeout 设上样量为70mL(1%柱体积);PumpFlow,设定上样流速60L/h,点击execute的同时将柱顶端四路二通阀调至管路与柱头相连,完成上样;5.3 洗脱5.3.1 将柱顶端四路二通阀调至管路与大气相连状态,在system control窗口点击manualvalvesInletA,选择inletA1,insert;InletB,选择closed,insert;Column,选择downflow,insert;PumpFlow,设定高流速(150L/h)点击execute运行,排气泡,同时将管路充满0.4M NaCl溶液,调流速至21L/h(30cm/h);5.3.2 待流速稳定后,在system control窗口点击manualvalvesInjection Mark,insert,点击execute的同时将柱顶端四路二通阀调至管路与柱头相连,开始洗脱,在一个柱体积左右,电导检测下将产生目的峰。5.4 测柱效在Evaluation窗口中,选择实验保存的结果,在结果图中点击鼠标右键,选择Properties,点击Clear,并选中Cond_102,点击OK。回到Evaluation窗口,选择积分按钮,在弹出窗口中,选择Cond_102,peak window中调整积分的范围,并在Reject Peaks中,填Peak must be one of 1 largest;确定后,在积分结果窗口,点击右键,选择Properties,在peak table选项中,勾选Plate Height(HETP)和Asymmetry。确定后即可计算得到计算理论塔板高度HETP和对称因子As。 1 When calculating the amount of media to be packed use the Compression Factor 1.1 instead of the Packing Factor above which is used during packing.10
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