多西紫杉醇诱导肿瘤细胞凋亡机制的研究目录摘要AbstrctI1.1 材料和试剂21.2仪器2细胞培养32.2细胞的维持和培养2.1 细胞的复苏42.2.2 A49细胞更换新的培养液42.2.3 细胞的传代 分组给药2.4 TT溶液的配置与检测5配制6第 章实验计算以及结果73.1 计算IC573.2实验结果7参考文献10摘要目的 观察多西紫杉醇诱导pg2 P3 MD-2 A49 四种肿瘤细胞凋零并对其作用机制进行探讨。方法 培养4种细胞,取对数生长期细胞分为五组，空白对照组、模型组、蜂胶黄酮高、中、低剂量组，剂量分别为200mg/、0 mg/L、50 m/L.药物预处理2h后,做MTT检测。通过实验数据计算C50.结果 各组细胞IC50值结论 多西紫杉醇对肿瘤细胞有诱导凋亡作用 关键词 多西紫杉醇；hepg2;A549;P3；M-231；细胞凋亡Abstract Study on the ffec ofdotxl ontumor clprolifeatinbition andtumor chmorap, tetecllcout, morphloic ovion, flow cytoetymthodfothe detection nd observatin respectivly and omne it oetaxelnproferationof hmantumr ellinn ud ice ering human mornhiition;to etablihanial mde, to e sepaey and combined wih docaxel,andbk ontrl. Obseraionof growth ad athological hracteritisofthe tuor bdy. rough theperimefMTTdetectin testof ctxl o mor cprlifaion inition sng diferentoncentrationo tumr cl supresson est， the inlene of the concentrtion on the survia of tmor celsTh exerienis divdedintto ats,specvely，nd M ectonf el cltr.Keyrs: oetaxe l Stem cel Rsach Appication 前言紫杉类药物属于红豆杉的树皮或针叶中提取或半合成的新抗肿瘤药物,作用在微管以及微管蛋白系统,紫杉类药物与其他植物碱不同,紫杉类药物通过促进微管双聚体装配成微管通过防止去多聚化过程而使微管稳定,阻滞细胞于 和 期，从而抑制癌细胞的有丝分裂和增殖。目前该类药物临床上有紫杉醇和多西紫杉醇doetax1等。采用多西紫杉醇治疗法具有来源广泛、容易获取、可迅速扩增、自体移植无免疫排斥等诸多优势，使其在细胞治疗及组织工程方面具有重要的研究价值及广阔的应用前景。第 1 章仪器与试剂1.1 材料和试剂 多西紫杉醇;A49细胞（肺肿瘤细胞） M23（乳腺肿瘤细胞) hepg2(肝肿瘤细胞) P3(前列腺肿瘤细胞） ；二甲基亚砜（DMSO）、胰蛋白酶、PS,购自于索莱宝；完全RPM1640 培养基、新生牛血清(N)，其它试剂均为分析纯。1.2仪器二氧化碳孵箱（hem）;单人双面超净工作台(SW-C）;倒置式生物显微镜(DS-1）;酶标仪（Infinite f200）;流式细胞仪（FCSCalibr）;高速离心机（TGL-16）；数控超声波清洗器(-600DB)；旋转蒸发仪（RE-2A 上海亚荣生化仪器厂)、恒温干燥箱(施都宝B80A)、恒温水浴锅(H.S2-)、超低温冰箱(termo）。第 2 章实验方法.1细胞培养A549细胞的培养A细胞为人肺腺癌细胞，属于传代细胞系，可稳定地传代培养。一般用胰酶消化后,加入生长液稀释,以1：21：3传代培养都是可行的。一、所需溶液1， 细胞冲洗液：磷酸盐缓冲液（BS）无Ca、Mg名称用量NACLKCLKH2O4NaHPO4 .。22O加水至 000mL,将H调至.4，高压灭菌。2， 消化液（1） 胰酶-PBS名称用量结晶胰酶高压灭菌后的PS00mlm的滤膜过滤除菌,分装备用,放置0保存。（2） 胰酶T：名称用量结晶胰酶DA盐溶液无、Mg PS00mlm的滤膜过滤除菌,分装备用,放置20保存。3， 细胞培养液：RMI6培养液配制方法:（1） 将一袋干粉型RPMI 160培养基溶于90ml三蒸水中,冲洗包装袋两至三次倒入培养液中。（2） 加入丙酮酸钠 0.g,NaHO2 2g以及双抗，加入磁力搅棒并置于磁力搅拌器上充分搅拌。双抗的配置浓度为 100/ML 青霉素和10U/ML链霉素。（一般市售的青霉素为80 万 U瓶,将其溶解于4ml三蒸水中,每升培养液中加入0.5ml;市售的链霉素为00 万U/瓶，将其溶解于5ml三蒸水中，每升培养液中加入0.l）。（3） 调整培养液的值,用PH精密试纸观察 PH7.2即可。（4） 过滤法除菌,所使用的滤器为O2m滤膜，滤膜事先采用高压灭菌消毒。（5） 分装，加盖瓶塞,加封纱布报纸，用绳固定,放置20保存。2. 细胞的维持和培养2.21细胞的复苏（1）准备37恒温水浴锅,从液氮罐中取出存有A细胞的冻存管,迅速放于7温水中,用镊子夹住轻轻摇动使其迅速融化。() 800 ,0min离心。(3)在无菌操作台中采用7的乙醇彻底擦拭冻存管，然后打开冻存管，注意动作要轻柔。（4）用1m枪头将上清液去除,加入ml预热的细胞培养液将细胞吹散开,转移至cm培养瓶中。（5)补充4m的RPMI 640培养基，并且添加1%的胎牛血清。(培养基中含有牛血清则不用添加)(6)倒置显微镜下观察，37、%C培养。(7)24h后，更换新的培养液。(8）常规传代培养。2.A5细胞更换新的培养液（）无菌操作打开培养瓶瓶盖,倒掉培养液。()用BS反复冲洗细胞23遍。(3）加入新鲜的预热好的培养液及10%的胎牛血清。各种液体需要量(）表面积25cm75c20m2洗涤31胰酶1213培养液51020（） 倒置显微镜下观察,37、O培养。2.2.3 A54细胞的传代 无菌操作打开培养瓶瓶盖，倒掉培养液。向已经长满的细胞中加入消化液1ml,轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有的细胞表面，吸弃或倒掉，轻轻冲洗细胞表面遍，以尽可能去除原培养液中的牛血清。加入1ml消化液,在7培养箱中孵育58min后把培养瓶放置在倒置显微镜下观察,发现细胞的胞质回缩、胞间质增大后，立即终止消化。 加入5ml预热至37的培养液,用玻璃吸管反复吹打以分散细胞。吹打过程按顺序进行,从培养瓶底部一边开始到另一边结束，以确保所有的底部都被吹到。吸取一半的细胞悬液,接种到新的25c2培养瓶中，补足培养液,并且添加00%的胎牛血清。通常每瓶液体量为0m。倒置显微镜下观察,37、CO2培养。 分组给药在37,恒湿的%CO2细胞培养箱内培养549细胞,完全培养基为高糖DEM培养基中含1%新生小牛血清，加入10 g/l链霉素和0gml氨苄青霉素。细胞为上皮样贴壁生长，每2 d传代次,取对数生长期细胞用于实验。将细胞分为五组：空白对照组、模型组、多西紫杉醇高、中、低剂量组。加药前先将多西紫杉醇溶于DMSO中，再用完全培养基稀释,使药物终浓度为20 mgL、100 m、50mg/L，SO终体积为1,空白对照组及模型组加入含DMSO完全培养基。药物预处理4h后，2h后检测各项指标。 MT溶液的配置与检测MTT全称为3(4,5-Dimethylthiazo-2l)-,5-iphenylterzoliumbmide，汉语化学名为3-(，5二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Forazn)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。二甲基亚砜（MSO）能溶解细胞中的甲瓒,用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内,MT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。 .1配制 称取MT 05克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中,用0.22m滤膜过滤以除去溶液里的细菌,放 避光保存即可。在配制和保存的过程中,容器最好用铝箔纸包住。T一般最好现用现配,过滤后4C避光保存两周内有效，或配制成5mml保存在20度长期保存,避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。配制MTT时用用PBS溶解,也有人用生理盐水配,0水浴助溶。 贴壁细胞1、收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,每孔加入100ul，铺板使待测细胞调密度至10100孔,(边缘孔用无菌PBS填充）。2、%CO2,37孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,前一天下午铺板,次日上午加药.一般57个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.3.、5%O2,37孵育168小时，倒置显微镜下观察。4、每孔加入2ulMT溶液(5mgml，即0.5%MT），继续培养h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含M的培养液。、终止培养,小心吸去孔内培养液。6、每孔加入10ul二甲基亚砜,低速振荡10，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪O40nm处测量各孔的吸光值。7、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、T、二甲基亚砜）第 3章 实验计算以及结果3.1 计算IC0(1)改良寇式法：C5