小鼠肺癌原位模型的建立Establishment of orthotopic lung cancer model in mice XU Zihang LIU Fei ZOU Chunpu ZHU Shiguo CHEN XiaoSchool of Basic Medical Science ， Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 201203 ，China Objective Morbidity and mortality remain high in lung cancer ， but the animal lung cancer models used for the experimental research are limited ， so to establish an orthotopic lung cancer model ， which is stable and similar to the human tumor microenvironment ， is a foundation for the further study of lung cancer research. Methods Luciferase-expressed LLC cells and matrigel matrix were directly injected into the left lung of C57BL/6 mice after cutting open a incision of the skin ， which about 1 cm ， and there was no need to open the chest. Small animal in vivo bioluminescence imaging system was used to monitor tumor growth and metastasis. At different time points ， mice were sacrificed and the lung tissues were isolated and imbedded with paraffin. Pathological diagnosis was madebysliced and HEstained. Results LLC cells (0.5 x 105) were enough to form an orthotopic pulmonary tumor ， and the success rate wasabove 90%. The metastases to contralateral thoracic ， contralateral lung ， bilateral axillary and inguinal lymph nodes were monitored by bioluminescence technique. Conclusion The orthotopic tumor models of lung cancer can successfully built by injection of luciferase-expressed LLC cells and matrigel matrix mixture. Furthermore ， a few LLC cells are needed ， and the tumor formation rate is high ，besides there is no operation death risk. It has good metastases and high repeatability， inaddition its easy to operate and easy to be monitored，which provides a good method for the establishment of mouse models for further study of lung cancer.目前，肺癌动物模型的构建方法有化学诱导法、转基因法、异位移植 法、原位移植法等。其中化学诱导模型耗时长，且诱导 出来的肿瘤存在较 大异质性 4 ，故有使用局限。转基因模型虽 对肺癌早期的发病机制及干 预性治疗效果的研究有很大帮助，但 是由于该模型存在造模时间难掌握、 花费较高、 数量上难以满足 实验要求以及转基因产物不一定符合要求等 问题 5 ，故亦存在 普遍使用的局限性。 在过去的几十年中， 异位移植 法中的皮下移 植是对肺癌进行实验研究的首选方法 6 ，由于其操作简单 方便， 通常只需在背部、腋部、后肢接种即可，但如今采取此种方法构建 的肺癌模型所得出的实验数据常遭到学者们的质疑， 认为其脱 离了源组 织的微环境，导致实验结果与临床治疗效果差异较大 7 ，此外，早在 1989 年外国学者 Paget8 的种子和土壤学说 也证实了器官微环境会影响肿瘤 细胞的表型表达， 而皮下移植瘤 模型转移发生率较小， 并且生存曲线的 数据不准确。 原位移植法 包括支气管内注射 9 、肺内注射 10-12 ， 以及外科植入新鲜肿 瘤组织 13 。其中支气管注射成瘤及瘤体大小、数 目均不稳定，故使用局限性较大。相关实验证明，在肺癌原位移植模型中， 瘤 块外科原位移植法比肿瘤细胞悬液原位注射法转移率高， 转移的 发生 也具有与临床相似的时间依赖性， 但是由于其创伤大、 手术 病死率高、 实验动物生存时间短，不宜普遍推广 13 。而本研究 构建的肺癌原位模 型是在以往的肺内注射法的基础上继续改良 创新，以期构建出更为理想的 小鼠肺癌原位模型。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 细胞系 Lewis 肺癌(lewis lu ng carci noma , LLC),源于C57 BL/6 小鼠，属鼠源性的非小细胞肺癌细胞株，购于中 科院。1.1.2 细胞转染所需材料 转染试剂 Lipofectamine2000TM 购于 Invitrogen 公司,潮霉素(Hygromycin B)购于 Roche 公司，RPM1 -1640 购于 HYCLON 公司，OPTI-MEMI 购于 Invitrogen公司1.1.3 实验动物 C57 BL/6 小鼠购自上海斯莱克实验动物 有限责任公司(SCXK(沪)2007-0005),雄性，5周龄，17只，体重18 22 g。 所有小鼠在SPF级屏障系统中饲养实验室使用许可证编号：SYXK(沪)2009-0069。饲养室相对湿度为（55土 10） %温度为（22士 2）C,光照12 h明暗交替，小鼠所用 饲料为上海仕林生物科技 XX 公司生产的辐照鼠料。1.1.4 matrigel 基质胶 / 基底膜 BD MatrigelTM matrix Basement Membrane （ BD公司，产品编号：356234）标准型浓度，-20C下冷冻 保存，避免多次冻融。1.1.5 活体成像仪器 Caliper 精诺真生物发光 / 荧光活体 分子成像系统（ IVIS ？?R Lumina XR Imaging System ） 铂金埃 尔 默（Perkin Elmer），型号：Lumina XR，成像图片分析软件：LuminaH living image 4.3。1.2 方法1.2.1构建表达荧光素酶的LLC稳转细胞系本实验所用质粒载体是 EGFP-FFLuc-HyTk-pMGyac该载体同时表达绿色荧光蛋白（GFP、虫 萤光素酶（luciferase）、潮霉素（hygromycin B）和自杀基因（Tk基因）， 是由本研究组通过材料转移协约(material transfer agreement , MTA 从德州大学 MD 安德森置于 5%CO2 饱癌症中心获得。用含10%台牛血清和1%T链霉素的RPM1-1640培养液 培养LLC细胞。转染前将细胞接种于35 mm培养皿中,和湿度的 37C 培养箱中培养。当细胞达到 70%- 80% 融合浓度时开始转 染。转染24 h后加入600卩g/mL的潮霉素进行抗性克隆筛选，兆选GFP 阳性克隆，然后用300卩g/mL的潮霉素进行维持。1.2.2 动物模型的建立 配制细胞混悬液： 将含有表达虫 萤光素酶的LLC细胞（0.5 X 105个）50卩L的细胞悬液与50卩L的matrigel基质胶等体积混匀2 将其抽吸入事先预冷好的胰岛素注射器。麻醉定：使用浓度为1%剂量为 5 mg/kg 的戊巴比妥钠将小鼠麻醉定。剃毛：用剃毛器将小鼠左胸部及腋 下的黑毛剃除干净，以充分暴露左侧胸壁。剪开皮肤：于小鼠左腋前线下1 cm 处用左手持镊子将皮肤拎起2 右手持眼科手术 剪将皮肤横向剪开约1 cm 的小口。定位：观察小鼠心脏搏动处2将心脏定位好后再水平向左移动 皮肤切口 2 可发现与心脏暗 红色组织不同的白色实质性的左肺组织。 进针： 定位好后将事 先抽吸好的胰岛素注射器插入左肺，进针深度 3 mm,角度以垂直为佳 2 注射完后停顿 5-10 s 2 再在伤口上滴洒含庆大霉素的 生理盐水少许。缝合：切口缝合1 2针。伤口护理：最后在伤口上涂抹红霉素眼膏2 帮助伤口愈合 2 造模完成。1.2.3 小动物活体成像操作方法小鼠于造模后进行活体成像2 首先 给予小鼠腹腔注射虫萤光素酶底物2 浓度为 15 mg/mL2 剂量为150 卩L/只，底物作用时间5 min , 5 min后予以异氟烷吸入麻醉5 min，然后 再放入主机箱内，曝光 10 s 后进行图像拍摄。构建原位模型，于小鼠左肺注射等比例的 LLC-虫荧光素 本酶细胞（0.5 x 105个）与 matrigel 基质胶混悬液共100 卩 L。 同一只 小鼠按上述方法造模后分别于术后的第4、11、18天进行活体成像。 2 结果2.1稳定表达虫萤光素酶的LLC细胞系构建完成由于EGFP-FFLuc-HyTk-pMGpa（载体在同一启动子下表达EGFP （增强型绿色荧光蛋白）和虫荧光素本酶，因此， EGFP勺 表达代表了虫荧光素本酶的表达。如图1 （圭寸三）所示，LLC细胞在转染EGFP-FFLuc-HyTk-pMGFa质粒DNA后,稳定表达EGFP表 示稳定表达虫荧光素本酶的LLC细胞系构建成功，可以用于进一步研究。2.2 小动物活体成像结果将模型小鼠于造模后的第 4天按照上述操作方法进行第 1 次 活体成 像，结果如图 2（圭三），共造模 17只小鼠，除第 8号 小鼠出现腹腔种 植转移外，其他 16 只小鼠均在胸部出现明显荧 光素酶信号，表示在胸部 有肿瘤形成，其造模成功率为94%。2.3 病理学检测 小鼠活体成像结果说明在小鼠胸部有肿瘤形成， 进 行病理检查进一步明确肿瘤在肺组织内而非在胸腔内。 按照常规病理切片 流程， 取材：将 10只小鼠于术后第 4天活体成像后处死并立即 进行活体取材， 取出肺组织， 此时肉眼观察肺组织尚未见明显的 病变表现;接着使用 10%中性福尔马林溶液肺部灌流、定 ;二甲苯透明、浸石蜡、包埋、切片、HE染色：二甲苯脱蜡2次，各10 min，无水乙醇漂洗二甲苯2次，各1 min;95%酒精1次，1 min, 90%酉精1次，1 min，85%酉精1次，1 min，自来水冲洗2 min;苏木精染色 4 min ，自来水冲洗 1 min;1% 盐酸酒精分化 20 s ，