资源预览内容
第1页 / 共5页
第2页 / 共5页
第3页 / 共5页
第4页 / 共5页
第5页 / 共5页
亲,该文档总共5页全部预览完了,如果喜欢就下载吧!
资源描述
WB注意事项及常见问题WB注意事项及常见问题 注意事项 一、 样本收集 1. 组织样本 原则上要求客户或我们的技术员把组织分切剪碎至研磨管,并加入适量裂解液和研磨珠,然后放置于-80保存。具体详情参照“组织样本收集注意事项.doc”; 2. 细胞样品 原则上要求客户或我们的技术员不要用胰酶把细胞消化下来,特别是分选对象是膜蛋白时,具体详情参照“细胞样品收集注意事项.doc”; 二、 总蛋白提取 1. 组织样品 具体详情参照“组织样本收集注意事项.doc”;记得加入蛋白酶抑制剂,如果分选对象是磷酸化蛋白时,记得加入磷酸化酶抑制剂; 2. 细胞样品 具体详情参照“细胞样品收集注意事项.doc”;记得加入蛋白酶抑制剂,如果分选对象是磷酸化蛋白时,记得加入磷酸化酶抑制剂; 三、 蛋白样本保存 裂解细胞或组织提取总蛋白时,细胞碎片沉淀一般-20保存以防万一,提取好的蛋白样品分装2份,一份加入上样缓冲液变性后-20保存,一份直接-20保存; 四、 蛋白变性 提取好的总蛋白取一部分加入上样缓冲液进行加热变性,变性好的蛋白应该-20保存,冻融后不再需要加热变性; 五、 SDS-PAGE 1. 浓缩胶的胶浓度一般为5%,用于压沉样品; 2. 分离胶的胶浓度取决于分析对象的分子量大小,详情见Western Blotting 全攻略.pdf第4页; 3. 分离胶和浓缩胶的高度比为8:3; 4. 电泳结束后,应及时用清洗干净玻璃板,清洗时应使用海绵擦布,切勿使用刷子,以免刮花玻璃板; 5. 电泳结束后,应及时冲洗电泳槽,以免盐离子沉积,导致电泳丝腐蚀; 6. 清洗电泳芯时,一定要注意别弄段电泳丝; 六、 转膜 1. 注意海绵垫,滤纸,转印膜,胶的叠放位置,以保证正确的转印方向; 2. 注意海绵垫,滤纸,转印膜,胶的相对大小,以免造成短路; 3. 转印结束后,应及时取出转印膜,并立即用TBST漂洗1-2遍,并立即加入封闭液,这样可以避免膜上的杂质残留或膜变干导致背景高的问题; 4. 转印结束后,应及时冲洗转印槽和转印芯,以免盐离子沉积,导致电泳丝腐蚀; 5. 转印结束后,应及时用水泡洗海绵垫和滤纸,以免盐离子沉积,导致转膜时短路,并放在篮子上晾干,如果海绵垫和滤纸不及时晾干,容易导致海绵垫和滤纸内部的结构破坏; 七、 封闭 1. 进行封闭时,应加入足量的封闭液,并保证整个封闭过程中,膜与封闭液充分接触,避免长时间离开封闭液,特别进行4静止封闭过夜时,一定要加入足量的封闭液和保证平坦放置;上述注意事项主要为了避免膜变干,导致背景升高; 八、 一抗杂交 1. 一抗的稀释比例:第一次使用时参考具体抗体说明书建议的稀释比例,并根据实际的实验结果进行调整; 2. 杂交条件:如果是室温孵育,至少保证孵育1-2小时,并放置脱色摇床上进行摇晃,如果是4孵育,应孵育过夜,可静止亦可放置脱色摇床上进行摇晃; 3. 应使用专用的一抗稀释液进行稀释,使用后进行回收并4保存,如果回收的稀释抗体用沉淀或长菌,应丢弃; 九、 一抗杂交后洗膜 1. 一般使用标准的TBST缓冲液,如果判断因为是一抗的原因导致的背景过高,可以把NaCl的浓度提高到500 nM (标准的为150nM); 2. 一般洗涤3次,每次10min,如果判断因为是一抗的原因导致的背景过高,可以把洗涤次数提高到4-6次; 十、 二抗杂交 1. 二抗的稀释比例:第一次使用时参考具体抗体说明书建议的稀释比例,并根据实际的实验结果进行调整; 2. 杂交条件:一般室温孵育,孵育1小时即可,并放置脱色摇床上进行摇晃; 3. 应使用封闭液进行稀释,使用后进行不回收; 十一、 二抗杂交后洗膜 1. 一般使用标准的TBST缓冲液,如果判断因为是一抗的原因导致的背景过高,可以把NaCl的浓度提高到500 nM (标准的为150nM); 2. 一般洗涤3次,每次10min,如果判断因为是一抗的原因导致的背景过高,可以把洗涤次数提高到4-6次; 十二、 拍照 1. 注意选择曝光时间,同时兼顾工作效率,因选择连续拍照模式,这样总有一个何时曝光时间; 十三、 报告单整理 1. 原始图片; 2. 对比度和亮度调整的图片; 3. 图片说明:上样顺序; 4. 灰度值:原始值,数据标准化,相对表达量的数据标准化比值),参照样品的相对表达量一定为1; 5. 实验方法:准确的一抗,二抗,稀释比例; 常见问题 一、 没信号 1. 膜一片空白,没有任何条带,阳性对照样品也无条带:实验失败?抗体失效?;重新进行实验,重新稀释抗体; 2. 膜一片空白,没有任何条带,阳性对照样品有条带:实验样品降解?实验样品无该蛋白的表达?转膜效率过低?;重新进行实验,复核查找上述原因,以寻找对策; 二、 背景过高 1. 目的条带以外的区域有信号,如果是片状,甚至整块膜,一般是封闭不好,膜变干,一抗非特异杂交或二抗的非特异杂交导致;如果是条纹状,一般是由于膜上有压痕导致,如果是点状,一般是膜上有杂质,或泡膜时膜没有充分浸泡; 三、 杂带 1. 目的带以外的信号条带为杂带,一般由于一抗的特异性不好所导致,如果目的带比杂带信号强,可通过减低一抗的稀释比例,并缩短杂交时间解决;如果目的带比杂带信号弱,在不减低一抗的稀释比例的前提下,缩短杂交时间;并提高TBST缓冲液的NaCl的浓度提高到500 nM; 2. 杂带如果与目的带的位置相距较远,可以不优化实验,直接裁剪即可,杂带如果与目的带的位置相距较进,应调整胶浓度,并延长电泳时间,已经采取上述解决方法; 四、 目的带弱 1. 一抗效价低:提高一抗稀释比例,提高杂交时间,减少洗膜次数,提高曝光时间,提高上样量; 2. 转膜效率低:检测转膜试剂和耗材,优化转膜条件; 五、 复合问题 上述问题往往同时出现,首先客观冷静分析问题所在,针对问题采取相应策略,有些策略可能互相矛盾,应以解决主要问题为主;
网站客服QQ:2055934822
金锄头文库版权所有
经营许可证:蜀ICP备13022795号 | 川公网安备 51140202000112号