流式细胞仪实验方法一、实验准备1标本制备： 2最小化非特异性结合：二、凋亡1凋亡的检测方法：和其它2PI 染色法3Annexin V 法4 TUNNEL 法三、细胞因子1激活的细胞因子2CBA四、血小板1活化2活化检测3网织血小板五、红细胞1网织红细胞2PNH3胎儿红细胞六、肿瘤学1DNA 细胞周期2蛋白3多药耐药4微小残留白血病第一部分 标本处理一、流式细胞术常规检测时的样品制备(一)直接免疫荧光标记法取一定量细胞(约1X106细胞/ ml),在每一管中分别加入50ul的HAB,并充 分混匀，于室温中静置 1 分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫 标记反应(如做双标或多标染色,可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入),。孵育20-60分钟后，用PBS(pH7274)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机 检测。本方法操作简便,结果准确,易于分析,适用于同一细胞群多参数同时 测定。虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光 的干扰，因此更适用于临床标本的检测。(二)间接免疫荧光标记法取一定量的细胞悬液(约1X106细胞/ml),先加入特异的第一抗体，待反应完全 后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原抗体抗抗体复 合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。本方法费用较低， 二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。但由于二抗一般为多克隆抗体，特异 性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。所以标本制备时应加入阴 性或阳性对照。另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定 细胞数较少的标本。二、最小化非特异性结合的方法 1荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性 的相互作用的增加而增加。2在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白 (BSA)，脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。这个步骤通过阻断第一抗体和细胞表面或胞内结构的非特异性的交互作用来降 低背景。3在使用第一抗体之后，将样品与5%至10%的来自于同一寄主的正常血 清和作为标记的第二抗体一起培育。这个步骤会减少不必要的第二抗体与第一 抗体、细胞表面或胞内结构之间的交互作用。通过用来自于同样的样品的血清稀释标记过的抗体可以略过此步骤。此步 骤适用于很多方面，但有时候它也会导致已标记的第二抗体和正常血清中的免 疫球蛋白的免疫复合体的形成。这种复合体会优先与一些细胞结构进行结合， 或者它们最终会导致期望得到的抗体活性的丢失。4. 使用F(ab )2片段会使背景决定于第一或第二抗体与FC受体的全分子 结合。大多数的第二抗体的 F(ab )2 片段容易利用。而第一抗体的 F(ab )2 片段一般是不能利用或很难制作。因此，在NaN3存在的条件下，将新鲜组织或 细胞与正常血清一起培育应选择优先加入第一抗体。在此情况下，即使在随后 的步骤中用完所有的抗体分子，FC受体决定的背景影响已不再重要。5 其它：已标记的抗体和其他一些内在的免疫球蛋白或加入实验系统中的 其它物质的交叉反应也可能会有背景影响。为了降低背景，在多重标记过程中， 所有的已标记的抗体应被吸附，避免其他种类蛋白的交叉反应。第二部分细胞因子细胞内细胞因子的流式细胞仪检测一、简介随着研究的进展，仅仅对细胞进行定量和活性的检测已不能满足需要。在 单细胞水平研究细胞因子的表达能力对研究细胞因子在疾病中的作用越来越显 的重要无比。目前检测单个细胞特定细胞因子的表达手段包括：ELIspot、原位 杂交、免疫细胞化学、限制性稀释分析(limiting dilution analysis, LDA)和 单细胞PCR,应用原位杂交技术和免疫组化方法观察细胞因子蛋白表达及 mRNA表达可以识别Th1和Th2细胞，此方法可获得较强的细胞内信号，但此 方法工作量大、主观性强，难以进行大样本检测，且人肉眼识别能力有很大的 局限性，而ELISPOT及单细胞PCR技术，技术性强、劳动强度大，难以进行 广泛推广。随着多标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的出现，使对细胞内 细胞因子的研究推向了一个新的阶段。下面主要对胞内细胞因子流式细胞技术 作以介绍。早期细胞因子表达与细胞功能相关性研究是基于特定克隆细胞的激活。尽 管研究应用T淋巴细胞克隆证明了不同细胞因子的合成，如TH1(IL2, IFN )与TH2(IL4, IL5, IL10),但这些研究很难外推，因为T细胞克隆与 体内T细胞功能相关性还未被揭示。近来，Jung与Picker采用了 monensin、PMA等药物预孵，用 Brefeldin(BFA)、Monensin阻断了胞内高尔基体介导的转运的方法使得细胞因 子聚集，蓄积，增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。因为自然状态下，T淋 巴细胞产生少量的细胞因子，通常要对T淋巴细胞体外活化进行研究。在体外 刺激过程中，T淋巴细胞产生的细胞因子已释放出来，胞内细胞因子信号较弱， 难以进行检测。这一方法可检测单个细胞内多个细胞因子，并可区分表达特定 细胞因子的细胞亚群。在细胞水平该方法证明了人与鼠的淋巴细胞都存在1型 与2型分化，且这些分化在特定细胞因子增强时可被逆转。且这些研究清楚地 证明，只有激活的细胞亚群可以表达细胞因子，静止的正常淋巴细胞(T、B、NK) 不能分泌细胞因子。胞内流式分析法是用抗细胞因子抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志组 合，即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌，同时采用特殊的化学与抗体选择， 确保静止与无细胞因子分泌细胞的最小荧光背景。具有其它方法难以比拟的优 点： 快速:流式定量检测细胞内细胞因子可在一天内完成，实验流程需6-8小时,实际操作时间为 1-2小时，快速简便；简便：无需组织培养，可以全血分析，无需分离PBMCs；灵敏度高：高度灵敏的荧光标记与检测系统；高效：可以在同一个细胞内同时检测两种或更多种细胞因子，也可根据细胞 免疫表型区分分泌细胞因子的细胞的亚型，进行多参数相关分析；安全：减少样本处理与生物源性污染接近生物体的分析条件：全血检测保留细胞及生化微环境更准确反映了体内 状况。二、所需仪器1. 流式上样管及细胞培养皿或板2. 25%CO2, 37C孵箱3. 混匀振荡器4. 离心机5. 加样器、Tips6. 流式细胞仪三、常用的标本类型和处理方法全血：使用肝素钠抗凝的真空采血管采血，不易采用肝素锂、EDTA和ACD 抗凝剂，血样在8小时内分析，超过8小时会导致活性的损失，一般细胞因子 阳性细胞会减少5%。如不能在8小时之内检测，应将真空采血管水平室温放置。自身血浆中外周血单个核细胞(PBMCs):使用肝素钠抗凝的采血后，分离PBMCs， 24小时内分析。组织培养基中的外周血单个核细胞(PBMCs):用Ficoll分离PBMCs，将 细胞重悬于含10%热灭活胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养基中，调节细胞 浓度为2X106细胞/ml。细胞系与T细胞克隆：调节细胞浓度2X106细胞/mL于新鲜培养基中。 冰冻全血与PBMCs :使用1X红细胞裂解液处理活化的外周血或者 PBMCs，用PBS漂洗，并用含1%的BSA及10%的DMSO的PBS重悬，一 70C冻存。溶化后细胞置于染色管中，加上23mL的洗液，离心5分钟后， 用破膜剂对细胞进行破膜和染色。四、所需试剂1、细胞表面染色的荧光标记的单抗试剂依据实验需要选择特殊表面标志CD45圈定所有淋巴细胞CD3圈定T淋巴细胞CD4圈定T辅助淋巴细胞亚群CD8圈定T抑制淋巴细胞亚群CD19/或 CD20圈定B淋巴细胞CD56圈定NK淋巴细胞CD14圈定单核细胞2、荧光标记的细胞因子抗体：R&D提供FITC、PE和APC标记的细胞因子抗 体3、溶血素：用外周全血检测时需使用溶血素(R&D目录号WL1O0O用于人或者WL20OO用于小鼠；eBioscience目录号00-4333)溶解红细胞4、激活剂 Phorbol 12-Myristate 13 Acetate(PMA) ( Alexis ，目录号ALX-445-004-M001)A. DMSO中调节浓度01mg/mLB. 分装(20 L),20C储存。勿反复冻融C. 每次实验用无菌无叠氮钠PBS 1： 100稀释储存液D. PMA终浓度25ng/mL细胞悬液 Ionomycin(Alexis,目录号 ALX-450-006-M001)A. 于乙醇中配制成浓度05mg/mLB. 20C储存C. 每次实验用无菌无叠氮钠PBS 1： 10稀释储存液D. Ionomycin终浓度1 g/mL细胞悬液 Staphylococcal enterotoxin B(SEB) (Sigma,Catalog No.S-4881)A. 无菌无叠氮钠PBS调节浓度0.5mg/mLB. 4C储存C. SEB终浓度10 g/mL细胞悬液 CD3：包被在培养板中，在蛋白转运抑制剂存在下活化未稀释的血液细胞 CD28:加速不同刺激剂(包括SEB、CD3等)的活化效应，浓度一般为10ug/ml5、阻断剂阻断高尔基体介导的转运作用，使得刺激细胞表达的细胞因子聚集在胞浆内 Brefeldin-A(BFA) (eBioscience,目录号 00-4506)A. 于DMSO中调节浓度5mg/mLB. 分装（20 L）, -20C储存。勿反复冻融。C. 每次实验用无菌无叠氮钠PBS 1： 10稀释储存液D. 激活最后4-5小时BFA终浓度10 g/mL细胞悬液。注意：BFA过度孵育会导致细胞活力下降Monensin （eBioscience,目录号 00-4505）6、不含谷氨酰胺的RPMI-16407、固定剂：细胞在体外刺激后需要对细胞进行固定。固定的目的在于通过蛋 白的交联和变性一方面使细胞因子固定在细胞内，另一方面避免细胞表面抗原 丢失。含4%的多聚甲醛PBS溶液（eBioscience,目录号00-8222）8、破膜剂:含1 %皂甙、0.05%叠氮化钠的Hanks溶液（HBBS）（eBioscience, 目录号00-8333）将细胞膜穿孔，已利于荧光标记的细胞因子抗体进入细胞内，于相应的细胞因 子结合9、其它试剂：无菌无叠氮钠PBS,乙醇，含1%多聚甲醛的PBS, 4C储存。五、细胞培养和刺激的基本方法细胞活化的最终结果是产生细胞因子，根据检测指标和标本的不同，研究 人员需要选择不同的刺激剂和刺激时间，以获得最佳的实验结果。下表提供了 检测一些常用细胞因子的推荐的活化方法。表1、细胞内细胞因子流式检测推荐的阳性对照活化方法检测细胞因子阳性对照刺激方法人 IFN-y方法2 （4-24小时）人 TIMP-1方法5人 TNF-方法7 （6小时）人 IL-1a方法3 （6小时）人 IL-1方法3 （24小时）人 IL-2方法2 （4-24小时）人 IL-4方法4人 IL-5方法1人 IL-6单核细胞：方法3 （6-12小时）T细胞：方法6人 IL-10方法1人 IL-12方法8人 IL-15方法3人 Fractalkine/CX3CL1方法1人 IL-8/CXCL8方法3 （24小时）人 MCP-1/CCL2方法3 (24