氧化应激与糖尿病视网膜病变凌静，栾洁中国江苏省南京市，东南大学附属中大医院眼科【摘要】 糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病最常见和最严重的微血管并发症之一，目前发病机制尚未明确。氧化应激与多种代谢异常、细胞因子活化以及细胞凋亡等关系密切并相互作用，在DR的发生、发展过程中可能发挥了关键性作用。抗氧化剂阻滞DR的作用在动物实验中得以证实，但临床试验结果却不确定。目前有大量关于氧化应激与DR的研究，并且也有众多学者致力于抗氧化剂在DR治疗作用方面的研究，本文就相关研究进展做一综述。 【关键词】 氧化应激；糖尿病视网膜病变；抗氧化剂 糖尿病患者因糖代谢障碍导致全身各组织器官的微血管发生病变，其中糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是其最严重的微血管并发症之一1，也是目前发达国家成人致盲的主要原因2。目前DR的发生机制尚未明确，Brownlee3提出的糖尿病慢性并发症的统一机制学说认为：引起糖尿病各并发症的四条经典通路，即多元醇通路激活、晚期糖基化终末产物（AGEs）增加、蛋白激酶C(PKC)激活、氨基己糖途径，实质上都是高糖诱导过氧化物过表达的结果，氧化应激是糖尿病并发症发生、发展的重要因素4。 1氧化应激在生理状况下，呼吸链电子传递过程中可以产生超氧离子（O2-）（占耗O2的1%4%），体内其他物质（如黄嘌呤）氧化时也可产生O2-。O2-可进一步生成H2O2和羟自由基（OH）等，统称为活性氧（reactive oxygen species，ROS）。细胞在维持其正常功能的过程中均在不停地制造ROS，而正常的氧化代谢中产生的ROS都能被体内有效的清除系统清除。若ROS产生和清除之间的失衡，就会导致ROS水平升高，引起组织损伤，即发生氧化应激。ROS化学性质活泼，很快就会与周围物质反应，故难以直接检测。而DNA、蛋白质和脂类受到氧化损伤后生成的氧化产物可以作为反映氧化应激的标志物。8羟基脱氧鸟苷酸(8OHdG)，在体内较为稳定、易于检测，被视为DNA氧化损伤的生物标志物。蛋白质氧化损伤的一个重要标志物是硝基酪氨酸(NT)。脂质的过氧化产物大部分源于不饱和脂肪酸，易于分解为一些化合物，其中包括异前列腺素类分子、正构醛、丙二醛、丙烯醛等。 2糖尿病中的氧化应激 目前已经有很多研究都证实了糖尿病时，O2和上述氧化应激间接标志物的表达都是增加的。动物研究表明糖尿病新西兰家兔血浆中的O2-和F2异前列腺素（一种异前列腺素类分子）水平较对照组升高3。Nishikawa等6研究发现，高糖可以作为一个独立因素而引起2型糖尿病患者血浆和尿中的8OHdG水平增高。针对1型糖尿病患者的研究发现，血浆NT水平升高7，尿中的F2异前列腺素水平明显升高，使用胰岛素控制血糖后F2异前列腺素明显下降，但仍高于正常对照组8。这些都直接或间接证实了糖尿病时氧化应激的存在。糖尿病的氧化应激可能源自于葡萄糖自氧化作用、氧化还原反应平衡的偏移、组织中抗氧化剂例如还原型谷胱甘肽(GSH)，维生素E的减少以及抗氧化防御系统相关酶例如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶（CAT）的活性下降9。 3氧化应激与糖尿病视网膜病变 视网膜有大量的多不饱和脂肪酸，而且摄氧量和葡萄糖氧化作用均高于其他组织，这使得视网膜对于氧化应激更加敏感。Du等10研究发现，在糖尿病大鼠视网膜和高糖培养的传代视网膜Mller细胞、牛视网膜内皮细胞中，O2的水平都是升高的。Kowluru等11研究表明即使糖尿病大鼠血糖控制良好，视网膜中增多的氧化应激标志物仍不会明显下降，这说明氧化应激不仅参与了DR的发病过程，还与代谢记忆现象（血糖控制良好后DR仍不可逆）相关。糖尿病时，视网膜中的抗氧化防御酶（包括SOD、CAT、谷胱甘肽还原酶、谷胱甘肽过氧化物酶）均减少9。另外，在高糖诱发的氧化应激中，非酶类的抗氧化剂(例如维生素C、维生素E、胡萝卜素等)在人体血液中的浓度也明显下降12。所以目前认为氧化应激是DR发病机制中的一个关键环节。 3.1氧化应激与多条代谢通路的关系 氧化应激除了损伤生物大分子外，还和与DR密切相关的代谢通路有着错综复杂的关系，这其中包括多元醇途径、晚期糖基化终产物（AGEs）途径、蛋白激酶C（PKC）途径、氨基己糖途径等。 3.1.1多元醇途径 多元醇途径是葡萄糖代谢途径之一，涉及葡萄糖向山梨醇的转变过程，此反应中醛糖还原酶是限速酶。糖尿病中增加的多元醇途径之所以会增强氧化应激，是因为醛糖还原酶需要NADPH，而多元醇途径活性增强通过和谷胱甘肽还原酶竞争NADPH而导致NADPH相对不足，这样胞内的抗氧化剂GSH的再生受到限制13。而醛糖还原酶抑制剂可以对抗糖尿病患者视网膜中蛋白质和DNA的氧化损伤14。 3.1.2 AGEs途径 AGEs是葡萄糖及其自身氧化后的酮糖和蛋白质副链通过非酶促反应形成的，并随着葡萄糖的增加而增加。在视网膜病变的晚期，AGEs不可逆转地存在并且在视网膜毛细血管细胞内堆积，AGEs途径被认为是通过激活核转录因子NFB继而导致进一步的细胞损伤来产生过量的ROS15。AGEs增加视网膜血管细胞的蛋白质氧化损伤并促发一系列通过激活NFB和caspase3而导致视网膜毛细血管细胞凋亡的事件16。 3.1.3 PKC途径 高糖增加ROS的产生以及甘油二酯的合成，进而增强PKC的活性。激活的PKC会引起一系列DR特征性的改变，包括血管渗出增多，血流量增加，激素水平和生长因子受体再循环的改变，刺激新生血管形成，内皮细胞增殖和凋亡，以及一系列因子例如血管内皮生长因子（VEGF）、胰岛素样生长因子1（IGF1）和转化生长因子（TGF）活动的调节。Wu等17研究发现PKC特异性抑制剂（LY333531）可以通过抑制PKC活性来预防糖尿病引发的氧化应激。此外，动物研究表明缺乏PKC类似物的大鼠不出现糖尿病引发的氧化应激18。这些资料都表明PKC与氧化应激确有联系，支持PKC在ROS介导的糖尿病并发症中发挥作用。 3.1.4氨基己糖途径 ROS抑制3磷酸甘油醛脱氢酶(GAP DH)，导致所有糖酵解的产物转向氨基己糖途径，产生二磷酸尿嘌呤N乙酰葡萄糖胺（UDPGlcNAc），而UDPGlcNAc是包括转录因子在内的细胞内因子转录后修饰的底物。激活的氨基己糖途径产生的氨基葡萄糖可增加H202水平，而抗氧化治疗可以阻滞氨基己糖途径所致的糖基化作用和其他有害作用19。但是目前关于氨基己糖途径在DR发生发展过程中发挥的作用的研究仍然较少。 3.2氧化应激与细胞因子的关系DR的发生发展受到多种细胞因子的影响，而氧化应激与这些细胞因子之间也有着密切的关系。 3.2.1血管内皮生长因子血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）是一种血管生成诱导剂，对于视网膜色素上皮细胞有促有丝分裂作用，还可以增加血管通透性20。不论是非增殖性DR还是增殖性DR，它都在其中发挥着介质和起始因子的作用，临床及动物实验均已证实DR个体眼内特别是视网膜局部存在高水平的VEGF21。在糖尿病微血管并发症中，氧化应激在高糖引发的VEGF病理学作用过程中发挥了一定的作用。ROS可以导致大鼠视网膜神经节细胞层、内核层以及色素上皮细胞（RPE）层以及体外的人的RPE、牛血管平滑肌细胞中VEGFmRNA和蛋白的表达上调，而使用抗氧化剂可以抑制这种上调22。 3.2.2色素上皮衍生因子色素上皮衍生因子（pigment epitheliumderived factor,PEDF）被认为是最有效的天然的血管抑制因子，也被证明与主要的血管刺激因子VEGF之间存在一种互逆的调节23。近年来的研究一致认为在DR中PEDF是一个保护性因子，且很多研究认为它的保护作用是通过抗氧化的特性来实现的21。Amano等24进行的细胞培养研究表明，PEDF可以保护周细胞免受AGEs的损伤；AGEs或ROS可抑制视网膜周细胞内PEDFmRNA的表达，造成PEDF水平下降，而PEDF水平的下降又可以进一步加剧氧化应激诱导的周细胞凋亡及功能障碍，继而促进DR的发展25。 3.2.3胰岛素样生长因子1胰岛素样生长因子1（insulinlike growth factor1,IGF1）是一种具有胰岛素样作用的多肽类因子，对于内皮细胞有直接促有丝分裂作用，包括促进细胞增殖、分化以及新生血管形成，还可以通过激活PKC刺激葡萄糖转运至视网膜微血管内皮细胞内，并可以调节VEGF活性的表达26。尽管IGF1在DR发病机制中的确切作用尚不明朗，但是氧化应激可能通过PKC途径调控IGF1。 3.3氧化应激和细胞凋亡 在疾病的特征性组织病理学改变出现之前，细胞往往就已经出现凋亡加快，DR也是如此。暴露在高糖环境的周细胞和内皮细胞或者糖尿病动物都发现氧化应激增加，caspase3活性增加以及其他转录因子表达增加，这些都会导致毛细血管细胞死亡27,28。在糖尿病小鼠视网膜微血管中观察到dUDP切口末端转移酶标记物（TUNEL）阳性细胞29。一些生物化学研究也证明了糖尿病视网膜中Bax（一种促凋亡蛋白）表达的增加，这是凋亡在组织学上的证据30。 尽管DR的确切信号步骤还不明确，但是已发现视网膜细胞凋亡与氧化应激活化caspase家族和NFB是相关的，糖尿病时抑制过氧化物的堆积可以阻滞视网膜毛细血管细胞的凋亡31。氧化应激导致凋亡增加的机制很复杂，可能与膜脂质过氧化作用、细胞生存所需大分子的损伤、信号转导和基因表达的改变相关。ROS可以通过改变细胞氧化还原电位、消耗GSH和降低ATP水平来导致细胞凋亡。ROS的释放增加视网膜细胞线粒体的通透性，触发细胞色素C从线粒体中释放，Bax移位至线粒体，继而通过激活caspase家族而导致细胞凋亡，在糖尿病视网膜以及视网膜毛细血管细胞中均发现胞质中细胞色素C和线粒体中Bax的表达增加32。Caspase家族是一组介导细胞凋亡必需的半胱氨酸蛋白酶，目前认为它们对于氧化应激非常敏感。ROS导致的线粒体功能障碍，使得细胞色素C由线粒体释放至细胞质，激活caspase9，进而引发一系列激活caspase3的级联效应，而caspase3发挥的是裂解DNA的作用。糖尿病大鼠视网膜中caspase3是被激活的，而给予抗氧化剂的治疗也抑制了caspase3的活性28，这表明氧化应激增强可以通过caspase3途径促进视网膜细胞凋亡。 另一种细胞凋亡介导物是对于氧化还原反应敏感的NFB。尽管NFB是发挥阻滞还是促进凋亡的作用取决于细胞类型和疾病状态，多数研究认为糖尿病导致的视网膜以及视网膜毛细血管细胞中NFB激活是促进细胞凋亡的。有研究27发现，在细胞凋亡或者发现组织病理学改变之前，高糖培养的视网膜毛细血管内皮细胞和周细胞或者糖尿病动物视网膜中NFB即已被激活，在病理组织学进展的同时NFB的激活一直在持续，而给予抗氧化剂治疗可以在不改善血糖的情况下抑制NFB的激活，表明NFB的激活是DR的一项早期征象，抗氧化剂的治疗潜能也可能包含了抑制NFB以及其下游路径的激活。 4抗氧化剂治疗糖尿病视网膜病变 大量研究都提示，氧化应激是DR发生发展过程中的重要因素，而抗氧化剂可以抑制ROS的生成、清除自由基、增强抗氧化防御系统的功能，所以恰当地使用抗氧化剂在治疗DR方面具有很大的潜能。 -硫辛酸是一种对于巯基二硫键转换起作用的抗氧化剂。它可以清除ROS，还原谷胱甘肽来维持一个健康的细胞氧化还原状态