百日咳杆菌毒素自从1909年发现百日咳杆菌对热不稳定毒素(heat-labiletoxin,HLT)或称皮肤坏死毒素后，百日咳杆菌的活性物质不断被分离和提纯，其中与致病有关的物质陆续被发现。与百日咳杆菌致病有关的物质除荚膜外，尚有百日咳杆菌的菌毛成分、内毒素(endotoxin)、百日咳毒素(pertussistoxin,PT)和腺甘酸环化酶/溶血毒素(adenylatecyclase/hemolysintoxin,ACT)等：内毒素即百日咳杆菌脂多糖(LPS);百日咳毒素由于其多重作用而有不同的命名，如因能提高小鼠对组织胺、5-羟色胺等的敏感性而被称作组织胺敏感因子(histamine-sensitizingfactor,HSF),因能促进白细胞、淋巴细胞增生又被称作白细胞增生因子或称淋巴细胞增生因子(leukocytosispromotingfactor,LPF),因能使百日咳杆菌粘附于呼吸道纤毛上而使细胞损伤导致阵发性咳嗽又被称作气管细胞毒素(trachealcytotoxin,TCT);ACT能促进巨噬细胞内的cAMP增加而抑制巨噬细胞功能，而且此环化酶毒素又能活化胰岛B细胞导致大量胰岛素分泌而有被称作胰岛素活化蛋白(islets-activatingprotein,IAP);百日咳杆菌有菌毛血凝素(fimbrialhemagglutinin,FHA)和白细胞增生因子-血凝素(lymphocytosis-promotingfactorhemagglutinin,LPF-HA)，使病人淋巴细胞增多，两者对小鼠均有免疫保护活性。近年对百日咳杆菌的研究热点主要集中在调控百日咳毒素表达的天然启动子和百日咳疫苗的研制上。现将起主要毒素及疫苗的研究进展分述如下。一.内毒素(1-3)百日咳杆菌脂多糖又称耐热毒素，是百日咳杆菌的被膜成分。与其他细菌的内毒素同样，其介导活性的主要部分为LPS的类脂A(lipidA)结构。1 .化学性质早期采用热酚/水法提取百日咳杆菌的LPS(Westphaletal,1952),以后有人用超速离心进行纯化并用各种蛋白酶处理以得到高纯度的LPS,各种不同菌株获得的LPS产量为634mg/g细菌干重。百日咳杆菌内毒素的主要特征是含有两种不同成分的LPS,分别称作LPS-I和LPS-II。LPS-I和LPS-n两者比例为2:3。两组分均存在于百日咳I相菌和部分IV相菌。这两组分的差别在于分子的类脂部分不同，一种分子的类脂连着2-3个脂肪酸而另一种含有3-5个脂肪酸，而且脂肪酸的组成也较特殊，含有罕见的2-甲基-3-羟基葵酸和2-甲基-2-羟基四葵酸，其他的成分如磷酸盐、葡萄糖胺、四葵酸、3-羟基四葵酸和3-羟基葵酸大致一致。类脂部分与多糖以3-脱氧-2-辛酮糖酸(KDO)分子相连，但KDO分子在两种LPS中磷酸化程度不同。将百日咳杆菌LPS用4mol/LHCl在100c水解，得到一种含分支的三糖，即4-O-(2-氨基-2-脱氧-a-D-口比喃葡萄糖基)-6-O-(2-氨基-2-脱氧-a-D-口比喃半乳糖基尿喀咤)-D-口比喃葡萄糖。此分子皆存在于两种LPS中。用质谱法精确测定百日咳杆菌LPS的类脂部分的分子量，结合31P-NMR的结果推断的百日咳杆菌类脂A的结构见图1。2 .百日咳杆菌LPS的毒性百日咳杆菌LPS具有明显的致热原性、Shwartzman反应、佐剂活性并具有增强对感染的非特异抵抗力活性等，现将百日咳杆菌LPS的活性小结于表1。表1百日咳杆菌LPS的生物学活性试验方法小鼠体重增长试验(18-20g 小鼠)家兔热原性试验家兔局部Shwartzman反应保护反应：诱导小鼠对伤寒、 大肠杆菌、肺双、绿脓杆菌 和金葡菌感染的非特异性抵 抗力(LPS和各菌攻击，相 隔3天)佐剂作用：在流感病毒疫苗 对小鼠的佐剂活性注射24h,体重改变的最大 剂量为1皿g2 g/kg剂量，最大平均升 高温度为2 c阳性反应的敏感剂量介于12.5-200 科 gLPS剂量在12.5-200上g,对 所有攻击菌具有显著保护 作用，最大保护作用是对肺 双，最弱保护作用是对绿脓抗病毒血凝素抗体年度增 高2.5倍.对热不稳定毒素百日咳杆菌培养于合适的固体或液体培养基中，从陈旧培养基的上清液或新鲜收集的百日咳杆菌破碎后离心所得的上清即可得到HLT。1. HLT的理化性质在不同型分离得到的HLT含量和毒性不一，光滑型新分离培养物含有较大量毒素，而小菌落变种具有高度毒性。从新鲜细菌破碎提取的HLT毒性较强。提取的流程如下：6%NaCl洗下培养于马铃薯甘油血培养基的百日咳杆菌一35c干燥3天一与NaCl结晶混合磨成粉一高速离心一DEAE-纤维素吸附，在pH值7.1下0-1mol/LNaCl梯度洗脱一硫酸钱盐析活性组分再溶即得到高度纯化的HLT纯化的HLT为蛋白质，存在于细菌的细胞壁，超速离心在1.4S,分子量约为89Kd,含14.6%的氮和1.4%还原糖，无脂类和磷酸根，能被胰蛋白酶消化，但不被DNA酶或RNA酶消化。纯化的HLT最小致死量为6-10pg/小鼠，对豚鼠的最小皮肤坏死剂量为0.01pg。HLT在5-22C保存于水溶液两天，活性就尚失25%,37c两天或40c9小时95%的毒性消失，因此称作对热不稳定毒素。利用这一性质，可以在37C用0.3%的福尔马林脱毒制备类毒素。干燥的HLT的毒性相对较稳定，保存于50%葡萄糖或蔗糖也可保持稳定性，但碱性有利于毒素的破坏。2. HLT的毒性与致病性HLT为一种高度毒性蛋白，其毒性在体内及体外均可损伤各种组织，能引起气管和支气管纤毛上皮细胞炎症和坏死，在百日咳致病上具有重要意义。用纯化的HLT给豚鼠和小鼠腹腔或静脉内注射，肝脏、脾脏和肾脏出现明显坏死、充血、出血和退行性变。将粗提的HLT感染绵羊、猪和鸡，也引起皮肤坏死，其毒性反应和家兔与豚鼠试验相似。典型者，当小鼠注入HLT后，脾脏苍白和明显萎缩，在7天内脾脏平均重量自51mg降至13mg,组织学检查末发现红髓，仅有少许脾小体，在小体之间空隙充满结缔组织，淋巴细胞大量减少，肝脏的重量也减少并出现轻度细胞萎缩，腹腔伴有腹水。HLT能直接作用于呼吸中枢，提高吸气和呼气反射中枢的兴奋性。HLT对体外培养组织细胞有杀伤作用，如HeLa细胞、鸡胚肺上皮细胞、原代鼠胚及KB细胞具有杀伤作用。HLT对神经组织的作用表现在：注射少量毒素于豚鼠、小猫或小狗脑内或脑膜中，引起动物惊厥和大脑损伤的症状，豚鼠通常在5-24小时内死亡。典型的组织学变化是：脑细胞发生水肿，脑膜血管周围、神经组织和脑室等都有白细胞浸润，细胞核变化，胞浆颗粒性物质减少和空泡形成。3. HLT的免疫性先前认为HLT无抗原性，后来证实HLT粗制品经福尔马林脱毒后，能使儿童和实验动物产生抗体，该抗体能中和HLT皮肤坏死作用和致死活性。HLT不易在体内显示抗原性的原因可能是HLT为弱抗原性，容易在动物体内被破坏，尤其脾或淋巴结阻止毒性作用不能刺激抗体产生，且HLT与菌细胞浆内结合，致使不能很好刺激机体产生抗体，如用类毒素，则能刺激机体产生抗体。用HLT抗毒素能保护小鼠腹腔内百日咳杆菌的攻击，而免死于毒血症；抗毒素对鼻内攻击百日咳杆菌而至的动物肺部感染也有保护作用；但用百日咳杆菌攻击小鼠脑内则无保护作用。这些结果致使百日咳杆菌HLT的保护性抗原研究尚未得出定论，但大多数人认为百日咳的抗度免疫极为重要，在制备疫苗苗时应该含有HLT类毒素。三 .百日咳毒素(PT)(5-14)由于以前提取和制备的差别以及百日咳毒素的多种生物学活性，致使百日咳毒素有许多别名。现在从基因的角度已经清楚，百日咳毒素是6个亚基组成的蛋白复合物，但只有5个亚单位，即S1、S2、S3、S4、S5之间的比例为1:1:1:2:1而形成6个亚基的复合物，分子量为105Kd。1. PT的制备与纯化PT在先前用不同的纯化方法得到后，在某方面观察到效果而被命名为不同的名称。这里介绍Munoz等(1981)的方法，这一方法相比较而言得到较纯的PT,而其他的方法要么太粗或者把6个亚基给将解了。将百日咳杆菌培养于Stainer和Scholte综合液体培养基中，经36c孵育5天，除去菌细胞的上清液用冰醋酸调pH至6.5,然后每升中加入0.5g/ml的ZnCl220ml,离心收集沉淀物，按上清也量每升加入10%Na2HPO4溶液37ml,使Zn-蛋白复合物溶解，离心取沉淀，用50mmol/L的Tris-HClNaCl缓冲液pH8.0(TNB)37ml抽提两次以上，混合抽提液，以5mmol/LTris-HClpH8.016ml连续透析3次，进一步离心收集沉淀物，再以0.1mol/L焦磷酸钠pH10.5提取，其抽提物再以低pH的TNB等容积稀释，未溶的沉淀物再按上述方法提取两次以上。将此含有PT的抽提物进行SepharoseCL-6B(2.5X90cm)层析，收集各组分，真空超速离心，所得的活性部分在通过生物凝胶-A0.5M过柱，过柱的活性部分混合在离心浓缩，置2-5C经2-3周，PT结晶。2. PT的活性以上述结晶的PT给CFW小鼠腹腔所得到的活性如表2。表2PT注射CFW小鼠后的主要活性血凝反应5300U/mg组织胺致敏0.5ng（50%致敏剂量）增高胰岛素浓度2ng增高血管渗透性0.5ng增高抗体应答0.1ng白细胞增生作用8-40ng毒性反应（小鼠腹腔）546ng超急性实验性过敏性脑脊髓炎（Lewis大鼠）20ng在观察PT所致的炎症反应时,Munoz等（1984）用PT与福氏完全佐剂或不完全佐剂分别注射/、鼠，结果发现：当小鼠足垫注入福氏完全佐剂和静脉注入PT后，足垫炎症反应发展显著，而不注入PT的小鼠足垫肿胀不明显。上述结果提示PT能显著增强福氏佐剂引起的炎症反应，重要有单核细胞浸润。同年他们发现小鼠实验性过敏性脑脊髓炎的发生可由于PT的作用而加强。PT能诱导低蛋白血症和增高皮肤和骨骼肌毛细血管渗透性。小鼠静注PT后，在第一天和第十天采血，正常小鼠血浆蛋白浓度为6.020.06g/100ml,而试验鼠为5.190.07g/100ml。血浆蛋白减低的主要是白蛋白，可能与PT使皮肤血管渗透性增高和骨骼肌血管渗透性增高所致。3. PT的免疫性与致病性现在基本已确认PT是百日咳杆菌最重要的毒力因子。早期的实验已经证实（Vogel等，1985）:PT在百日咳杆菌感染早期可抑制免疫应答，可认为它是通过免疫抑制机理即阻碍初次抗体（IgM）应答，有利于病菌的感染和发展。初次抗体应答的抑制是由PT刺激Lyt2+淋巴细胞（抑制性/细胞毒性淋巴细胞），特别是Ts淋巴细胞增殖的结果。同时，PT是T细胞的丝裂原，抗体应答被抑制可能是PT刺激Lyt2+淋巴细胞诱生一种可溶性抑制因子（淋巴因子）一一丫-干扰素。后来许多学者都证实了这一实验。四 .百日咳疫苗研究进展（15-19）近年来的临床研究已经证明包含不同组分，如PT、FHA和菌毛等的无菌疫苗能够保护世界卫生组织（WHO）所定义的百日咳。从临床试验和对儿童的接种的结果来看，这种无菌疫苗的安全性优于传统的全菌疫苗。下表是在儿童接种全菌或无菌疫苗后的效果比较。表3儿童接种全菌和无菌疫苗后的比较疫苗名称抗原组成*（科g）开展临床研究的国家倩计的有效率（%）CLIPw全菌意大利/瑞典36/48PMPw全菌塞内加尔96WPw全菌英国93-94SBPa2PTd(25),FHA(25)瑞典59SBPa3PTd(25),FHA(25)