第十一章血清学试验第五节中和试验根据抗体能否中和病毒的感染性而建立的免疫学试验，称中和试验 (Neutralization test)。中和试验极为特异和敏感，既能定性又能定量，主要 用于病毒感染的血清学诊断、病毒分离株的鉴定、病毒抗原性的分析、疫苗免疫 原性的评价、血清抗体效价的检测等。中和试验可在体内进行也可在体外进行。体内中和试验也称保护试验，试验时先对实验动物接种疫苗或抗血清，间隔 一定时间后，再用一定量病毒攻击，最后根据动物是否得到保护来判定结果。常 用于疫苗免疫原性的评价和抗血清的质量评价。体外中和试验是将抗血清与病毒混合，在适当条件下作用一定时间后，接种 于敏感细胞、鸡胚或动物，以检测混合液中病毒的感染力。根据保护效果的差异， 判断该病毒是否已被中和，并可计算中和指数，即中和抗体的效价。根据测定方 法不同，中和试验有终点法中和试验和空斑减数法中和试验等方法。毒素和抗毒素也可进行中和试验。其方法与病毒的中和试验基本相同。一、终点法中和试验终点法中和试验(Endpoint neutralization test)是滴定使病毒感染力减 少至50%时，血清的中和效价或中和指数。有固定病毒稀释血清和固定血清稀释 病毒两种方法。(一)固定病毒稀释血清法 将已知的病毒量固定，血清作倍比稀释，常用于 测定抗血清的中和效价。1. 病毒毒价单位 病毒毒价(毒力)的单位过去多用最小致死量(MLD)，但由 于剂量的递增与死亡率递增的关系不是一条直线，而是呈S形曲线，在越接近 100%死亡时，对剂量的递增越不敏感。而死亡率愈接近50%时，剂量与死亡率呈 直线关系，所以现基本上采用半数致死量(ld50)作为毒价单位，而且LD5。的计算应 用了统计学方法，减少了个体差异的影响，因此比较准确。以感染发病作为指标 的，可用半数感染量(ID/。用鸡胚测定时，可用鸡胚半数致死量(eld50 )或鸡胚 半数感染量(EID50)；用细胞培养测定时，可用组织细胞半数感染量(tcId50)。在 测定疫苗的免疫性能时，则用半数免疫量(imd50 )或半数保护量(pd50)。 502. 病毒毒价测定 将病毒原液作10倍递进稀释即10-1、10-2、10-3-，选择4 6个稀释倍数接种一定体重的试验动物(或鸡胚、细胞)，每组36只(个、L)。 接种后，观察一定时间内的死亡(或出现细胞病变)数和生存数。根据累计死亡数 和生存数计算致死百分率。然后按Reed-Muench法、内插法或Karber法计算半数 剂量。以TCID5 测定为例说明如下：按KarbWr法计算，其公式为lgTCID50=L+d(S-0.5)，L为病毒最低稀释度的对 数；d为组距，即稀释系数，10倍递进稀释时d为-1； S为死亡比值之和(计算固 定病毒稀释血清法中和试验效价时，S应为保护比值之和)，即各组死亡(感染) 数/试验数相加。若以测定某种病毒的TCID50为例，病毒作10-410-7稀释，记录其出现细胞病 变（CPE）的情况（表 11-1）。则则L=-4, d=-1, S=6/6+5/6+2/6+0/6=2.16lgTCID50=（-4） + （-1）X（2.16-0.5）=-5.66。TCID50=10-5.66, 0.1ml。TCID50为毒价的单位，表示该病毒经稀释至10-5.6： （ 1/105.66 ）时，每孔细胞接 种0.1ml，可使50%的细胞孔出现CPE。而病毒的毒价通常以每ml或每mg含多少 TCID5或（LD5等）表示。如上述病毒的毒价为 105.66 TCID50/0.1ml，艮口 106.66 TCIDjml。表11-1病毒毒价滴定（接种剂量0.1ml）病毒稀释CPE阳性数阴性数%10-46010010-5518310-6243310-70603.正式试验 将病毒原液稀释成每一单位剂量含200LD50 （或EID/ TCID50）， 与等量递进稀释的待检血清混合，置37C感作1h。每一稀释度接种36只（个、管）试验动物（或鸡胚、细胞），记录每组动物的存活数和死亡数，同样按 Reed-Muench法或Karber法计算其半数保护量（PDQ，即该血清的中和价。（二）固定血清稀释病毒法 将病毒原液作10倍递进稀释，分装两列无菌试 管，第一列加等量正常血清（对照组），第二列加等量待检血清（中和组）；混合后 置37C感作1h，每一稀释度接种36只试验动物（或鸡胚、组织细胞），记录每 组动物死亡数、累积死亡数和累积存活数（表11-2），按Karber法计算LD50， 然后计算中和指数。中和指数二中和组LD50/对照组LD50。按表11-3的结果：中和 指数二10-2.2/10-5.5=103.3,查3.3的反对数为1995，即10：=1995，也就是说该待检血 清中和病毒的能力比正常血清大1994倍。通常待检血清的中和指数大于50者即 可判为阳性，1040为可疑，小于10为阴性。表11-2固定血清稀释病毒法中和指数测定举例病毒稀释10-710-110-210-310-410-510-6LD50中和指数正常血清组待检血清组0/40/44/42/41/44/40/43/40/41/40/410-5.510-2.2103.3=1995二、空斑减数试验（Plague reduction test）空斑或蚀斑是指把病毒接种于单层细胞，经过一段时间培养，进行染色，原 先感染病毒的细胞及病毒扩散的周围细胞会形成一个近似圆形的斑点，类似固体 培养基上的菌落形态。空斑减数试验是应用空斑技术，使空斑数减少50%的血清 稀释度为该血清的中和效价。试验时，将已知空斑形成单位（PFU）的病毒稀释成每一接种剂量含100PFU，加等量递进稀释的血清，37C感作1h。每一稀释度 至少接种3个已形成单层细胞的培养瓶，每瓶0.20.5ml, 37C感作1h，使病 毒与血清充分作用，然后加入在44C水浴预温的营养琼脂（在0.5%水解乳蛋白 或Eagles液中，加2%犊牛血清、1.5%琼脂及0.1%中性红3.3ml） 10ml，平放凝 固后，将细胞面朝上放入无灯光照射的37C CO2培养箱中。同时用稀释的病毒加 等量Hanks液同样处理作为病毒对照。数天后分别计算空斑数，用Reed-muench 法或Karber法计算血清的中和滴度。