钙盐沉淀法提取柠檬酸摘要：利用黑曲霉进行分离复壮，然后利用改良的马丁培养基进行发酵，再通过离心发酵液， 利用两种不同的方法钙盐沉淀法和离子交换法进行分离柠檬酸，比较两种方法分离柠檬酸的 产量，及两种方法的优缺点，同时还要注意发酵过程中，菌种的产量。关键字；黑曲霉钙盐沉淀离子树脂交换 引言：生产史;1784年C.W.舍勒首先从柑橘中提取柠檬酸。他是通过在水果榨汁中加入石灰乳以形 成柠檬酸钙沉淀的方法制取柠檬酸的。天然柠檬酸最初产于美国加利福尼亚州、意大利和 西印度群岛。意大利的产量居首位。到1922年，世界柠檬酸的总销售额的90%由美国、 英国、法国等垄断。发酵法制取柠檬酸始于19世纪末。1893年C.韦默尔发现青霉（属） 菌能积累柠檬酸。1913年B.扎霍斯基报道黑曲霉能生成柠檬酸。1916年汤姆和柯里以曲霉 属菌进行试验，证实大多数曲霉菌如泡盛曲霉、米曲霉、温氏曲霉、绿色木霉和黑曲霉都 具有产柠檬酸的能力，而黑曲霉的产酸能力更强。如柯里以黑曲霉为供试菌株，在15 %蔗 糖培养液中发酵，对糖的吸收率达55%。1923年美国菲泽公司建造了世界上第一家以黑曲 霉浅 盘发酵法生产柠檬酸的工厂。随后比利时、英国、德国、苏联等相继研究成功发酵 法生产柠檬酸。这样，依靠从柑橘中提取天然柠檬酸的方法逐渐为发酵柠檬酸所取代。1950 年前，柠檬酸采用浅盘发酵法生产。1952年美国迈尔斯试验室采用深戻发酵法大规模生产 柠檬酸。此后，深层发酵法逐渐建立起来。深层发酵周期短，产率高，节省劳动力，占地面 积小，便于实现仪表控制和连续化，现已成为柠檬酸生产的主要方法。中国用发酵法制取柠檬酸以1942年汤腾汉等报告为最早。1952年陈声等开始用黑曲霉浅盘发酵制取柠 檬酸。轻工业部发酵工业科学研究所于1959年完成了 2001规模深层发酵制柠檬酸试验,1965 年进行了生产100t甜菜糖蜜原料浅盘发酵制取柠檬酸的中间试验，并于1968年投入生产。 1966年后，天津市工业微生物研究所、上海市工业微生物研究所相继开展用黑曲霉进行 薯干粉原料深层发酵柠檬酸的试验研究，并获得成功，从而确定了中国柠檬酸生产的这一主 要工艺路线。薯干粉深层发酵柠檬酸，原料丰富，工艺简单，不需添加营养盐，产率高，是 中国独特的先进工艺。中国石油发酵柠檬酸的研究起步较早。1970年，天津、上海沈阳、常州等地研究单位利用解脂假丝酵母（Candida lipolytica）进行石蜡油（正构烷烃）发酵 生产柠檬酸的试验。1979年徐子渊等筛选出一株对氟乙酸敏感的变异株解脂假丝酵母，其 乌头酸水合酶的活性很低，柠檬酸的生成比例从原来的50%提高至80%，从而提高了石油 发酵柠檬酸的产率。随着生物技术的进步，柠檬酸工业有了突飞猛进的发展全世界柠檬酸产量已达0.4Mt。在柠檬酸发酵技术领域，由于高产菌株的应用和新技术的不断开拓， 柠檬酸发酵和提取收率都有明显提高，每生产1t柠檬酸分别消耗2.52.8t糖蜜,2.22.3t 薯干粉或1.21.3t蔗糖。人们正在大力开发固定化细胞循环生物反应器发酵技术柠檬酸又名枸橼酸，外观为白色颗粒状或白色结晶粉末，无臭，有强烈的酸味，它存在于天然果实 中，其中以柑桔、菠萝、柠檬、无花果等含量较高。早期柠檬酸是以天然果实为原料加工而 成，1893年德国微生物学家Wehmen发现二种青霉菌能够积累柠檬酸，1951年美国Miles公 司首先采用深层发酵大规模生产柠檬酸。我国1968年用薯干为原料采用深层发酵法生产柠檬 酸成功，柠檬酸生产由于工艺简单、原料丰富、发酵水平高，至0世纪70年代中期，已初步 形成了生产体系。用做调味剂享有“西餐之王”美誉的柠檬具有很强的杀菌作用，对食品卫生很有好处，再 加上柠檬的清香气味，人们历来喜欢用其制作凉菜，不仅美味爽口，也能增进食欲。用于食 品加工柠檬酸常常作为酸化剂、pH缓冲剂来防腐，同时改善食品的感官性状，增强食欲和 促进体内钙、磷物质的消化吸收。用于化工、制药和纺织业柠檬酸属于果酸的一种，柠檬酸在化妆品中的主要作用是加快角质更新，常用于乳液、乳霜、 洗发精、美白用品、抗老化用品、青春痘用品等。角质的更新有助于皮肤的中黑色素的剥 落，毛孔的收细，黑头的溶解等，可以美白和去角质，柠檬汁稀释后可以当收敛化妆水用， 主要作用是收敛皮肤，因此比较适合油性皮肤 柠檬酸在水产养殖饲料中的作用：提高胃蛋白酶的活性柠檬酸能降低饲料的pH值，使水产 动物的胃内pH值下降，从而促进无活性的胃蛋白酶原转化为有活性的胃蛋白酶，促进矿物 质的吸收一些矿物质元素在碱性环境中易形成不溶性的盐而极难吸收，提高饲料利用率添 加柠檬酸和微生物植酸酶能提高植物性饲料中磷的利用率，减少无机磷的添加，并减轻水产 动物通过粪便排磷对水体环境的污染，柠檬酸在水产养殖饲料使用上的作用效果尚不够稳定黑曲霉1)国内外黑曲霉菌种选育研究概况。中国研究也取得了很大的成果。欧美是除中 国以外全球第二大柠檬酸主产区，柠檬酸生产企业的经济和技术实力比较雄厚，一般都是集 技术开发、工业设计和生产一体化的跨国集团企业，相比中国柠檬酸行业，在技术和管理上 具有很大的优势，在菌种的选育方面也比我们的经验丰富。本文研究的育种方法从我国的国 情出发，方法简单易学，效果显著，在目前生产分散，技术水平低的实际情况下具有一定的 借鉴和推广意义。2)黑曲霉(Aspergillus niger)的形态特征和生理特征。在固体培养基上，菌落由白色逐渐 变至棕色。抱子区域为黑色，菌落呈绒毛状，边缘不整齐。菌丝有隔膜和分枝，是多细胞的 菌丝体，无色或有色，有足细胞，顶囊生成一层或两层小梗，小梗顶端生成串分生抱子。黑 曲霉生产菌可在薯干粉、玉米粉、可溶性淀粉糖蜜、葡萄糖麦芽糖、糊精、乳糖等培养基上 生长、产酸。黑曲霉生长最适pH值因菌种而异，一般pH值为37；产酸最适pH值为1.8 2.5。生长最适(optimum)温度为3336C,产酸最适温度在2836C,温度过高易形成杂酸， 斜面培养要求在35Be左右的麦芽汁培养基上。黑曲霉以无性生殖的形式繁殖，具有多种活 力较强的酶系，能力用淀粉类物质，并且对蛋白质、单宁、纤维素、果胶等具有一定的分解 能力。黑曲霉可以边长菌、边糖化、边发酵产酸的方式生产柠檬酸。1)国内外黑曲霉菌种选育研究概况。产柠檬酸黑曲霉已经历了几十年的诱变 (induced mutation)筛选，对常用的诱变处理具有一定的抗性。中科院有人尝试把离子束应用于产柠檬 酸黑曲霉的诱变，并取得了一定效果。在此影响下，有人做过用低能离子束注入黑曲霉来优 化菌种的产酸能力。李文玲等也曾经用Co6gy射线诱变产柠檬酸的黑曲霉菌种，也取得了 很大的成果。欧美是除中国以外全球第二大柠檬酸主产区，柠檬酸生产企业的经济和技术实 力比较雄厚，一般都是集技术开发、工业设计和生产一体化的跨国集团企业，相比中国柠檬 酸行业，在技术和管理上具有很大的优势，在菌种的选育方面也比我们的经验丰富。本文研 究的育种方法从我国的国情出发，方法简单易学，效果显著，在目前生产分散，技术水平低 的实际情况下具有一定的借鉴和推广意义。2)黑曲霉(Aspergillus niger)的形态特征和生理特征。在固体培养基上，菌落由白色逐渐 变至棕色。抱子区域为黑色，菌落呈绒毛状，边缘不整齐。菌丝有隔膜和分枝，是多细胞的 菌丝体，无色或有色，有足细胞，顶囊生成一层或两层小梗，小梗顶端生成串分生抱子。黑 曲霉生产菌可在薯干粉、玉米粉、可溶性淀粉糖蜜、葡萄糖麦芽糖、糊精、乳糖等培养基上 生长、产酸。黑曲霉生长最适pH值因菌种而异，一般pH值为37；产酸最适pH值为1.8 2.5。生长最适(optimum)温度为3336C,产酸最适温度在2836C,温度过高易形成杂酸， 斜面培养要求在35Be左右的麦芽汁培养基上。黑曲霉以无性生殖的形式繁殖，具有多种活 力较强的酶系，能力用淀粉类物质，并且对蛋白质、单宁、纤维素、果胶等具有一定的分解 能力。黑曲霉可以边长菌、边糖化、边发酵产酸的方式生产柠檬酸。市场情况我国的柠檬酸产业，较早地进入了国际市场，经过多年的努力和奋斗已成为世界第一的 生产和出口大国。特别是经历了近几年的竞争与整合，全行业的面貌大为改观。尽管市场形 势严峻，效益滑坡，但行业同仁知难而进，骨干企业砥柱中流，仍然呈现了持续健康的发展 态势。_、柠檬酸行业及其科技进步概况1总产量稳定增加，品种不断延伸，集约化程度大幅提高。据不完全统计，2002年全国 柠檬酸总产量突破40万吨。2技术水平不断提高，消耗一降再降，生产成本压缩到新的水平，全面提升了中国柠檬酸的竞争力。3产品品质越来越为企业所重视，较几年前有了很大改善，中国柠檬酸产品的形象逐渐好转。安徽丰原生物化学股份有限公司经 过几年的培育，BBCA的品牌逐步被国际市场认可，享有很好的信誉。不少新建企业，从开 工之日起，就坚持很高的质量标准和以自己独立的品牌进入市场，这是富有远见的战略决策。 4新技术、新材料、新设备的应用有了很多新的收获。不少相关行业的成果，如酶技术膜 技术、微机技术和先进装置等越来越多地被采用。特别是提取技术的重大突破和新提取生 产线的建成投产，在柠檬酸工业史上，具有划时代的意义。5三废治理技术日渐完善，大多数企业建设了有效的废水处理装置，正常运行并注重实效。自去年三部委92号公告发 布后，更促进了业内企业对环境保护工作的高度重视。已有18家柠檬酸生产企业为省级环 保部门验收，被国家环保总局正式公布为达标企业。今年3月，国家环保总局、中国发酵工 业协会组织有关专家对部分达标企业进行了首次调研检查，结果基本满意，有的企业做得 很好。可以说，全行业已从建立处理设施进入有效治理阶段。6.对于新建、扩建项目，逐渐走出盲目发展、重复建设、大起大落的误区。西部大开发以来，我们曾经十分担心，不 少地方为解决粮食出路，发展出口商品，会利用政策倾斜，置生态环境于不顾，一哄而起大 上柠檬酸，然而由于市场经济体系走向成熟，柠檬酸市场长期低迷，国内投资体制渐趋完善， 地方政府较为理智，过去所谓的形象工程逐渐淡化，这种局面并未出现。现在虽然有一些新建、扩建工程在进行，大都经过认真的评估和论证，具有很强的比较优势。我国加入WTO后，柠檬酸工业继续发展壮大，2002年，柠檬酸出口量为26万吨，柠檬酸钠出口 量为2.58万吨，出口总量比上年仍增长3%。我国柠檬酸行业开始走上了持续健康的发展道 路。二、柠檬酸行业亟待解决的课题1 原料，至今仍是一个重要的课题。我们目前主要的原料是木薯和玉米。前者仍是粗 料发酵，它带来了一系列固有的缺陷，如培养基营养成分的波动；大量不参与生化反应的杂 质空耗能源，并给提取增加诸多负担；发酵液总糖浓度偏低，影响了发酵指数和设备利用率； 发酵液滤渣价值很低，难以综合利用等等。玉米原料也只能算是半精料发酵，为了调整氮 源，还要将一定比例的玉米粉直接进罐。由于要追求尽可能高的液化收率，总糖浓度也无 法调高，致使我们的发酵产酸，至今停留在12%13%的水平。玉米原料的综合利用也是个 大问题，我们除利用了淀粉之外，将其余部分都制成了廉价的饲料，太可惜了。所以，根 据各厂实际，选用更适合的原料，提高资源利用率，是很迫切的问题。2.菌种，近年来进展不大。随着分子生物工程的发展，为优良菌种的选育提供了更为广阔的天地，用基 因重组菌种取代，改良原有的柠檬酸、青霉素菌种已见诸报道。以基因工程手段改造传统 的发酵工业，已经不是遥遥无期的事，如果我们不努力攻关，今天的技术优势很可能在新一 轮的竞争中失去。这次会议，天津工微所介绍了他们在高糖发酵菌种和工艺方面的新成果。 随着发酵罐的日益大型化，它与手工麸曲制备的矛盾越来越突出，如何实现麸曲制备的工业 化，或代之以抱子粉，是多年未能突破的难题。自然，最为理想的是制成抱子粉或采用固定 化技术，只是