Therapeutic Antibodys Based Cancer Therapy基于抗体药物的我国生物制药产业化发展前景陈志南第四军医大学细胞工程研究中心/细胞生物学教研室肿瘤生物学国家重点实验室，西安，710032摘要：抗体工程药物是生物技术及其生物药物最重要的部分之一，它是以基因工程、细胞工程、发酵工程为工艺研发的生物技术产品，也是全球生物技术领域产业化最为成功的产品，它们集成了20世纪50年代以来生命科学发展最前沿的成果和生物工程最关键的技术，是生物制药实现产业化的重要标志。本文就将基于抗体药物的生物制药产业化发展前景予于阐述。关键词：抗体 人源化 生物制药近25年来，随着生物技术工业的快速发展，创造了35种重要的治疗性药物，其中北美地区拥有63%，欧洲拥有25%，日本拥有7%；其2007年销售额已达到828亿美元，增长率达到23%，其中美国占有全球市场的41%，欧洲25%，其他地区34%。抗体药物是近年来复合增长率最快的一类生物技术药物，全球年销售额从1997年的3.10亿美元上升2007年的258亿美元；其在生物制药产业中所占份额也从2000年的1/5上升到2007年的1/3；在2007年销售额前10位的生物技术药物中，抗体药物有5种，分别是利妥昔单抗（第2）、曲妥珠单抗（第3）、英利昔单抗（第4）、贝伐单抗（第6）、阿达木单抗（第9），其中4种销售额超过40亿美元。因此，抗体药物具有巨大的经济价值和社会价值 中国生物技术信息网 www.biotech.org.cn。抗体生产制备不仅提供现代生命科学研究的重要工具，在基因和蛋白质的结构和功能研究方面有着不可或缺的作用，同时更是生物制药领域的主要组成部分。抗体作为一个特异的接头分子是链接基因组、蛋白组和系统生物学的重要工具，它介导了靶分子之间的相互作用并发挥效应。目前，全球单克隆抗体已多于100,000种，工程抗体多于1,000种，诊断和治疗用抗体约500种，正在进行临床试验的抗体有100余种；同时，抗体的多样性及其抗原表位组的研究也是揭示生命免疫机制的重要途径。抗体药物治疗肿瘤有广阔的前景。实验研究表明，抗体对肿瘤细胞有选择性杀伤作用，有更高的疗效和较低的毒性，体内显示呈特异性分布，与肿瘤靶分子有特异性结合作用，并对抗药性肿瘤细胞也有杀伤作用。如Rituxan治疗B细胞性非霍杰金氏淋巴瘤已达30多万例病人，单药治疗总反应率为50%，其疗效与化学药物相同，但前者更安全，几乎无副作用，抗体联合化疗有效率高达80%以上 Cheson BD. Monoclonal antibody therapy for B-cell malignancies. Semin Oncol. 2006 Apr;33(2 Suppl ):2-14. ；针对血管表皮生长因子（VEGF）的抗体Avastin，使晚期结肠癌患者的生存期平均延长了5个月，FDA认为它几乎对所有的晚期结肠癌患者都有帮助，因此被批准作为晚期结肠癌的一线用药 Glusker P, Recht L, Lane B. Reversible posterior leukoencephalopathy syndrome and bevacizumab. N Engl J Med. 2006 Mar 2;354(9):980-2; discussion 980-2. 。该类药物一经开发就倍受关注。1 抗体工程的技术现状及发展趋势1.1 抗体高通量、大规模、功能化制备技术高通量抗体制备技术的发展十分重要。常见的方法如杂交瘤-快速筛选技术，工程抗体-抗体库和人记忆B细胞分选技术。近年来，Mathias Uhlen建立了高通量的单一性多克隆抗体制备技术。Elisabetta T改进了人记忆B细胞分选技术，用CpG寡核苷酸增加了B细胞永生化率，从而使单克隆抗体制备更加快捷有效。EPITOMIC公司发展了兔杂交瘤技术，克服了鼠杂交瘤的缺点，获得更多的低丰度及磷酸化蛋白质抗体；Hamers率先进行了骆驼抗体的研究 Perez JM, Renisio JG, Prompers JJ, etc. Thermal unfolding of a llama antibody fragment: a two-state reversible process. Biochemistry. 2001 Jan 9;40(1):74-83. ，只含有重链的抗体同样具有抗体功能，在中和毒素和酶功能拮抗等方面具有较好的发展前景；大容量甚至超大容量非免疫人抗体库技术的发展，使高通量筛选任何抗原的人抗体成为可能。过去，用常规免疫和融合免疫方法很难制备针对高度保守抗原稳定的单克隆细胞株，主要是因为初级GC形成和调节过程中自身反应性B细胞的早期清除作用。可溶性抗原直接连接到高亲和力抗原特异的GC的B细胞导致调亡并引起克隆缺矢的快速发生，证实了自身活性B细胞的早期清除作用，B细胞表达Bcl-2转基因鼠同结合多位点重复免疫（RIMMS）方法相结合可进一步增强对保守抗原的MAbs的产生 Wring SA, Kilpatrick KE, Hutchins JT, etc. Shorter development of immunoassay for drugs: application of the novel RIMMS technique enables rapid production of monoclonal antibodies to ranitidine. J Pharm Biomed Anal. 1999 Apr;19(5):695-707. 。同常规方法制备单克隆抗体相比，RIMMS有很多优点：采用结合多位点重复免疫RIMMS方法制备高亲和力的mAbs仅需要1-2只小鼠和少量的抗原（400ng-3g位点）或DNA（2.5-100g/位点），RIMMS还免除了免疫过程中试血过程。迄今为止，已经建立了快速制备方法，包括合成肽、重组蛋白、细胞提取物、连接复合物以及体内DNA免疫后表达蛋白等多种免疫原mAbs的方法, 并广泛用于ELISA、免疫沉竞争性联免疫印渍分析、免疫组织化学等方面的研究。今后，在阐明RIMMS机制的基础上，使用RIMMS方法，通过转染并鉴定可能进一步增加融合效率的其他细胞周期调控和信号蛋白，进一步澄清早期抗原驱使的体细胞超突变和亲和力成熟过程。由于它们与成熟记忆细胞的调节和产生有关，耐受或自身免疫紊乱机制可得以澄清。RIMMS也为构建免疫B细胞的组成多样化的噬菌体呈现库提供一条新的途径，在细胞不同时空的表达及其蛋白功能研究也有广阔的应用前景。因此，将消减免疫、RIMMS的方法与DNA免疫和细胞免疫的方法相结合，建立一种快速制备高亲和力抗体的方法，将大大缩短单抗制备的周期。1.2 动物细胞表达抗体产品大规模培养技术近年来，人们不断发展和完善了许多抗体分子的表达体系，如：细菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞、植物细胞表达系统和体外翻译系统等。哺乳动物细胞表达系统具有活性高、稳定性好等重要优点，已成为抗体等生物技术产品最重要的系统 Kushibiki T, Tabata Y. A new gene delivery system based on controlled release technology. Curr Drug Deliv. 2004 Apr;1(2):153-63. 。2007年销售额排名前列的6类生物技术药物中，有5类是由动物细胞表达生产（肿瘤治疗抗体类、抗TNF-抗体类、EPO类、干扰素类、凝血因子类），仅胰岛素类药物是由大肠杆菌和酵母表达的。欧美国家哺乳动物细胞表达产品种类占60%-70%，市场份额占65%以上。虽然该体系也存在着产率低、某些糖基化产物不稳定、不易纯化、费用昂贵和自动化水平低等不足，但是完整抗体分子量大、二硫键多、糖基化位点多、空间结构复杂，只有使用动物细胞表达系统，产业化才能成为可能。哺乳动物细胞表达生物技术产品大规模高效培养技术是生物医药产品主要的生产方式和关键“瓶颈”技术。目前，国际上该项技术发展较快，已趋成熟，以默克公司为代表的流加培养生产规模达10,000L以上，以贝尔公司为代表的灌流培养生产规模达200L以上，蛋白表达浓度为0.5-2g/L；我国在该技术领域起步较晚，基础较差，但近年来经过努力，已经实现了该项技术的突破，尤其是“十五”期间组成了以第四军医大学，华东理工大学，中国科学院，中国医学科学院，军事医学科学院组成的项目组，顺利完成了国家重大科技专项“动物细胞表达生物技术产品大规模高效培养技术平台”预定目标。上海中信国健药业有限公司、北京百泰生物技术有限公司也都应用了该项技术，目前我国该项技术的主要工艺，流加培养规模达到500L以上，灌流培养规模达到100L以上，蛋白质产量在0.2-1.0g/L。 建立了涵盖CHO、杂交瘤、HEK293、Vero和BHK等工程细胞的大规模批次、流加、灌流培养工艺，突破了系列动物细胞高效表达载体构建与优化技术、高通量细胞培养筛选系统、系列无血清培养基、无血清悬浮驯化技术、动物细胞代谢调控模式的优化、新型灌流培养细胞截留系统、无载体固定化培养分散控制技术、工艺过程多参数系统控制技术、自动程控反馈补料系统、生物反应器放大与强化技术等10项主要的生产关键技术。该技术领域在基地建设、人才培养、关键技术和生产放大工艺等方面都取得了较大的进展。建立了我国具有通用性、先进性、示范性和辐射性并有自主知识产权的动物细胞表达生物技术产品大规模高效培养技术平台，实现了该技术平台从无到有，从小到大的跨越，使我国在该生物技术平台领域逐步赶上世界先进水平，缩短了差距，为我国生物技术产品的产业化提供了关键技术支撑和部分源头创新技术。支持和带动了相关学科和生物医药产业的发展。1.3 人源化及全人抗体的构建及优化技术随着免疫学和分子生物学技术的发展以及抗体基因结构的阐明，DNA重组技术开始用于抗体的改造。抗体药物已经进入基因工程抗体时代。基因工程抗体具有以下优点：降低人体对异种抗体的排斥反应；减小抗体的分子量，利于其穿透血管壁，进入病灶的核心部位；根据需要，制备新型抗体；采用多种表达方式，大量表达抗体分子，降低生产成本。1.3.1 嵌合抗体：利用DNA重组技术将鼠单抗的轻、重链可变区基因插入含有人抗体恒定区的表达载体中，转化哺乳动物细胞表达出人鼠嵌合抗体，其人源化程度达到70%左右，完整地保留了异源单抗的可变区，最大限度地保持了其亲和活性，降低了免疫原性。我国目前该项技术已经成熟，军事医学科学院抗CD20，第四军医大学抗人HAb18G, CAb-3，中国医学科学院肿瘤研究所抗Her-2的嵌合抗体均已构建成功并进入研发阶段。1.3.2表面重塑抗体：对鼠抗体表面氨基酸残基进行人源化改造。该方法的原则是仅替换与人抗体SAR差别明显的区域，在维持抗体活性并兼顾减少异源性基础上选用与人抗体表面残基相似的氨基酸替换；另外，所替换的区段不应过多，对于影响侧链大小、电荷、疏水性，或可能形成氢键从而影响到抗体互补决定区（CDR）构象的残基尽量不替换。我国也已经开始这方面工作的尝试。1.3.3 重构抗体：由异源抗体中与抗原结合相关的残基与人抗体重新拼接构建的，包括CDR区移植，部分CDR移植和特定决定区（SDR）转移 Schelonka RL, Ivanov II, Jung DH, etc. A single DH gene segment creates its own unique CDR-H3 repertoire and is sufficient for B cell development and immune function. J Immunol. 2005 Nov 15;175(10):6624-32. 。我国在这方面工作已经取得进展，如北京天广