西南政法大学司法鉴定中心作业指导书文件编号FSC07TDM-2页号第1页共9页版次第一版第1次修改标题STR 与性别位点基因型检测审核人王旭东批准人易旻发布日期2008年11月18日1目的 通过对D3S1358等STR位点的基因型检测，进行亲子鉴定和个体识别。2适用范围 本作业指导书适用于法医物证学实验室对刑事、民事以及非诉讼案件中人体血液（斑）、羊水、带毛囊毛发、混合斑、精斑、组织等生物学检材的DNA基因型检验以及性别位点的检测。3职责 中心主任批准具有法医物证鉴定资格的鉴定人履行此项工作。4试剂 本法所用试剂为分析纯，在有效期内使用；使用pH试纸测定溶液的pH值。 4.1 10mg/ml蛋白酶K：lmg蛋白酶K溶于100l双蒸水中，每管30l分装，冰箱冻存。 4.2 lmol/L DTT：称取0. 77g DTT，加入5ml双蒸水，溶解后加入50l lmol/l NaAc(pH 5.2)，混匀。 4.3 Chelex 100 (50-100 mesh)：5g Chelex 100加双蒸水至50ml，检查pH为9-11。 4.4 0. 5mol/L EDTA：于800ml双蒸水中加入186. 1g Na2EDTA - 2H2O，在磁力搅拌器上搅拌溶解（可加20g NaOH助溶，此时pH=8.0士0.2)。检查pH，用水定容至1L。 4.5 Powerplex 16 System扩增试剂盒（Promega公司）：冰箱冻存。4.6 GeneScan-600 ILS ( Promega公司）：2-6保存。 4.7 POP-4(ABI公司）：2-6保存。 5设备仪器 5.1 310 型遗传分析仪。 5.2 9700型PCR扩增仪。 5.3 振荡器。 5.4 台式高速离心机。 5.5 恒温干燥箱。 5.6 计算机。6原理 从生物学检材中抽提DNA，针对D3S1358, TH01, D21S11, D18S51, Penta E，D5S818, Dl3S317, D7S820, Dl6S539, CSFIPO, Penta D，vWA, D8Sl l79, TPOX, FGA等STR位点和性别位点Amelogenin进行复合PCR扩增，将扩增产物进行电泳分析，确立基因型。7程序 7.1 DNA提取 7.1.1从血样中提取DNA： (1) 在1.5ml离心管中加1ml双蒸水，然后加入3l全血（约9mm2血斑），小心混匀；西南政法大学司法鉴定中心作业指导书文件编号FSC07TDM-2页号第2页共9页版次第一版第1次修改标题STR 与性别位点基因型检测审核人王旭东批准人易旻发布日期2008年11月18日 室温保温30min，间歇振荡； (2) 10000-15000 r/min离心2-3min；小心移去上清液。若样品为血斑，则保留载体； (3) 沉淀中加入10% Chelex 100 (50-100mesh) 200l; 56保温30min； (4) 高速振荡5-10sec; 100 8min； (5) 高速振荡5-10sec; 10000-15000 r/min离心2-3min，取上清液用于PCR扩增；2-8保存或冻存剩余DNA。 7.1.2从毛发中提取DNA： (1) 用三蒸水清洗毛发；剪取毛根部分；放入1.5ml Eppendorf管中； (2) 加入200l 10% Chelex 100(50-100 mesh）及2l 10mg/ml PK（蛋白酶K) , 56 保温6-8hr或过夜； (3) 高速振荡5-10sec；沸水煮8min(注意毛发应浸没于Chelex液）； (4) 高速振荡5-10sec；10000-15000 r/min离心2-3min；取上清液用于扩增反应，2-8保存或冻存剩余DNA。 7.1.3从口腔刮拭物样本中提取DNA: (1) 用牙签刮拭口腔粘膜，将其放入1. 5ml离心管内，加入200l 10% Chelex (50-100 mesh)；搅动，使细胞脱落； (2) 56保温15-30min； (3) 高速振荡5-10sec；100 8min； (4) 高速振荡5-10sec, 10000-15000 r/min离心2-3min； (5) 取上清液用于扩增反应；2-8保存或冻存剩余DNA。 7.1.4从唾液斑中提取DNA： (1) 取9mm2唾液斑放入1.5ml离心管中，加1ml三蒸水于室温浸泡30min； (2) 用牙签搅动使载体细胞脱离载体，去除载体；10000-15000 r/min离心lmin; (3) 去上清仅留50l，用无菌吸头吹打沉淀；加10 % Chelex 100 (50-100 mesh）至200l, 56保温15-30min; (4) 高速振荡5-10sec；100 8min; (5) 高速振荡5-10sec, 10000-15000 r/min离心2-3min；取上清液用于扩增反应；2-8保存或冻存剩余DNA. 7.1.5从精液中提取DNA: (1) 取3l精液放入1. 5ml离心管内，加入200l 10% Chelex 100(50-100 mesh) ; (2) 加入2l 10mg/ml蛋白酶K和7l lmol/L DTT，轻轻混匀； (3) 56保温30-60min，高速振荡5-10sec; (4) 10000-15000 r/min离心10-20sec; (5) 100 8min; (6) 高速振荡5-10sec; 西南政法大学司法鉴定中心作业指导书文件编号FSC07TDM-2页号第3页共9页版次第一版第1次修改标题STR 与性别位点基因型检测审核人王旭东批准人易旻发布日期2008年11月18日 (7) 10000-15000 r/min离心3min; (8) 取上清液用于扩增反应； (9) 2-8保存或冻存剩余DNA，再次使用时重复步骤6-8. 7.1.6从精斑样品中提取DNA: (1) 取适量精斑检材，剪碎后放到1. 5ml离心管中； (2) 加入1ml三蒸水，室温保温30min; (3) 高速振荡lmin，用牙签去除载体； (4) 10000-15000 r/min离心2min; (5) 去上清仅留50l，用无菌吸头吹打沉淀； (6) 取3l悬液经染色后镜检； 注：如果检出上皮细胞，则按混合斑DNA提取法操作； (7) 加入10 % Chelex100 (50-100 mesh）至200l，加入2l 10mg/ml蛋白酶K和7l lmol/L DTT，轻轻混匀； (8) 56保温60min; (9) 高速振荡5-10sec, 10000-15000 r/min离心10-20sec;(10) 100 8min; (11) 高速振荡5-10sec, 10000-15000 r/min离心3min; (12) 取上清液用于扩增反应； (13) 2-8保存或冻存剩余DNA，再次使用时重复步骤11-12。 7.1.7从混合斑样本中提取DNA: (1) 取适量检材，剪碎后放入1.5ml离心管中，加1ml三蒸水； (2) 室温浸泡30min; (3) 用牙签搅动2 min，使载体细胞脱离载体，去除载体（注意：待基液中镜检到精子后再弃去载体）； (4) 10000-15000 r/min离心lmin; (5) 去上清仅留50l，用无菌吸头吹打沉淀； (6) 取3l悬液放于载玻片上，经染色后镜检； (7) 如果无上皮细胞检出，则直接从步骤13开始操作； (8) 加灭菌水150l，再加2l10mg/ml蛋白酶K，轻轻混匀； (9) 保温1-2hr以消化阴道上皮细胞（注：不得超过2hr，否则精子细胞也会被消化）； (10) 10000-15000 r/min离心5min; (11) 取150l上清液与50l 40 % Chelex 100(50-100 mesh)混合，以备女性DNA分析检验，见步骤14; (12) 悬浮沉淀于0.5ml精子洗涤液（10 mmol/L Tris-HCl, 10 mmol/L EDTA,50mmol/L NaCl, 2 % SDS, pH 7.5)，振荡片刻，10000-15000 r/min离心5min，去上清仅留西南政法大学司法鉴定中心作业指导书文件编号FSC07TDM-2页号第4页共9页版次第一版第1次修改标题STR 与性别位点基因型检测审核人王旭东批准人易旻发布日期2008年11月18日50l，重复2次； (13) 悬浮沉淀于1ml三蒸水，振荡片刻，10000-15000 r/min离心5min，去上清仅留50l，用无菌吸头吹打沉淀，取3l镜检； (14) 加150l 10% Chelex 100(50-100 mesh), 2l10mg/ml蛋白酶K及7l lmol/L DTT，轻轻混匀； (15) 56保温60min; (16) 剧烈振荡女性阴道上皮细胞及精子细胞样品5-10sec，100 8min; (17) 高速振荡5-10sec, 10000-15000 r/min离心3min，取上清液用于扩增反应； (18) 2-8保存或冻存剩余DNA，再次使用时重复步骤16。 7.1.8从含精子的口腔拭子中提取DNA: (1) 用棉签刮拭口腔粘膜，取适量拭物放入1.5ml离心管中，加入1ml无菌双蒸水； (2)室温保温30min; (3) 用牙签搅动2min使细胞脱落，去除牙签和纤维； (4) 10000-15000 r/min离心2min; (5) 去上清仅留50l，吹打，取3l镜检。如果检出精子头，则按混合斑DNA提取法从步骤7开始操作。 本实验室常规采用Chelex法抽提DNA，对于质和量不确定的检验材料（如精斑、混合斑、石蜡包埋块等），在抽提DNA后，通过对DNA溶液进行系列稀释（如2倍、10倍、100倍），然后采用DNA扩增试剂进行扩增分析（操作按说明书进行），通过电泳条带荧光强度的观察确定适宜的DNA模板浓度，再正式按以下步骤进行检测。 7.2检测 7.2.1 PCR扩增 常规使用商品化的Powerplex 16 System试剂盒，进行15个STR位点及1个性别位点的基因型检验。若使用其他扩增检测体系，则必须先进行可行性测试，确认其合格。需要增加其他STR位点的检测时，可使