植物材料的固定、包埋和制片一、植物材料的固定和包埋在此过程应注意避免Rnase的污染。所使用的熔蜡管（管盖不能耐受180C烘，只需高压 湿热灭菌即可）、量筒、三角瓶和药勺均需180C烘5小时以上。所用蒸馏水无需用DEPC处理。 所固定的材料越小越好，尽可能切除多余的材料。材料取下后应立即固定。取材后若不能立即 固定，则应置于冰上运输。配试剂前请计算一下所需用量，用多少配多少，节约试剂。第一天一、配制甲醛溶液（以300 ml量为例）1、先打开一个60C左右的水浴锅。2、在通风橱中往三角瓶中加入12 g多聚甲醛（终浓度为4%）。3、用量筒配300 ml PBS缓冲液（30 ml 10XPBS+270 ml水），另加1粒NaOH，盖好锡 箔纸后，轻轻摇动，稍微溶化后置于水浴锅中溶解。4、完全溶解后，取出，加 0.1% Tween-20 （300 ul）和 0.1% Triton（300 ul）混匀（包 埋水稻时还要再加 3 ml 25%的戊二醛）。5、置于冰上或4C冰箱降至室温，然后用硫酸调pH至7.0o6、把配制好的甲醛溶液分装到小瓶中，（一般用10 ml的小瓶）。7、分装好的甲醛溶液应放置在冰浴中当天使用。二、固定材料1、取植物新鲜材料，去除不需要的部分至适当大小。注意：所固定的材料越小越好， 尽可能去除无用多余的部分。2、把取好材料放入冰浴的装有甲醛溶液的小瓶中。注意每瓶中的切块数：太多固定不 好；太少则浪费固定液（固定液:材料三20:1）。3、材料放入固定液后，应通过抽真空（1 至数分钟，视具体情况而定：尽可能短时间， 以材料沉入固定液中为准），帮助固定液进入组织中，以达到迅速固定植物材料的目 的。抽气减压时，尽量不要使液体过分沸腾。抽真空时，材料一般在固定液中浮起 抽完真空的材料应该沉入固定液中，有时可能要反复多次抽真空，直至材料沉没在 固定液中。一般抽真空多于 5 分钟大部份材料还不沉没在固定液中的情况极少见， 如果此情况发生，建议抽真空达10分钟后，继续做步骤4。4、抽真空后需要更换一次新鲜的固定液。5、更换新鲜固定液后，材料在4C过夜。注意：甲醛有剧毒，因此药品的称取和溶液的配置必须在通风橱中进行！多聚甲醛极易飞散； 称取时通风橱可暂不抽风；要避免将多聚甲醛洒落在天平或台面上造成污染，如有洒落，要及 时清理。第二天|按以下序列对材料进行脱水（水为高压灭过菌的双蒸水）。1、0.85% NaCl冰浴，30 分钟2、50%乙醇/0.85% NaCl冰浴， 5 小时3、70%乙醇/0.85% NaCl冰浴，5小时4、85%乙醇/0.85% NaCl4C，过夜注：进入50%乙醇后，材料应开始脱色。第三天1、 95%乙醇/水4C, 5小时2、 100%乙醇4C, 5小时3、 100%乙醇4C,过夜注：第三天起，每个脱水步骤时间可延长至一天。两次100%乙醇脱水后，材料应为无色。第四天1、100%乙醇2、50%乙醇/50% 二甲苯室温， 2 小时室温，1 小时3、 100% 二甲苯室温，1 小时4、 100% 二甲苯室温，1 小时5、 100% 二甲苯室温,1小时6、 50% 二甲苯/50%石蜡58C，过夜（使用熔蜡台）注：使用二甲苯后，应在通风橱中操作，要避免让在同一实验室工作的人闻到二甲苯的味道。第五至七天每天换两次100%石蜡（58C）,倾倒时避免产生气泡。注意：在换石蜡前1-2小时，把石蜡装于干净熔蜡管内，置于熔蜡台上熔化备用。第八天纸盒的处理：将折好的纸盒于氯仿（废氯仿可回收重复利用）中泡一会，再取出晾干。包埋蜡块：先准备一盆水放在旁边备用，再将大小合适的纸盒放在熔蜡台上（在纸盒上写明材 料的名称等有关内容），将新熔化的石蜡倾倒于此盒内，把材料放到此盒内。用加热的镊子迅速 把材料按需要的切面及材料之间的间隔排列整齐。用嘴吹气，使石蜡表面凝固形成一层薄膜时， 再平放入冷水中，使其尽快凝固，数秒后翻转蜡块。约半小时后取出，置于有吸水纸的塑料框 里晾干。包埋好的蜡块放入4C冰箱中备用。二、载玻片和盖玻片的处理1、 将挑好的载玻片和盖玻片放入洗液（2%HCl+70%乙醇溶液：70 ml无水乙醇+2 ml浓HC1+28 ml Hp 浸泡过夜，流水冲洗干净。2、准备2个烧杯的双蒸水、2个烧杯的95%乙醇和2个烧杯的无水乙醇，将洗好的载玻片和盖 玻片依次经过这6 个烧杯，在干的纸上蘸干酒精后，于酒精灯上烧干。3、烧好的载玻片和盖玻片放在折好的锡纸上晾干，最后用锡箔纸包裹。4、180C烘5个小时。5、 待载玻片冷却，加4 ul多聚-L-赖氨酸（1mg/ml）于一端。用盖玻片（已经过180C烘5 个小时处理）的一边接触液滴，进行涂片。涂片时应观察到“虹膜”的形成。注意：若涂片后多聚-L-赖氨酸不形成一层水膜，则表明载玻片没有洗干净，必须重洗。 请注意标记载玻片的哪一面涂有多聚-L-赖氨酸。6、 涂片之后放入37 C的烫板中干燥过夜（最短可以4小时，水干了即可），准备切片。经过 处理的载玻片应在一周内使用。7、最后封片用的盖玻片不需作任何处理。使用前用擦镜纸擦净即可（主要是防尘）。三、切片和展片1、修块。将包有材料的小蜡块（包含一个材料）初步修成六面体，粘在硬木块上。用刀片将 蜡块修成梯形，在材料的周围各留2mm的石蜡即可（尽可能少留）。2、切片。切片的厚度为7-10 um。在解剖镜下用暗视野观察蜡带，以决定取舍。3、展片。将DEPC处理过的蒸馏水滴加在涂有多聚赖氨酸的载玻片上（注意分清哪一面涂有多 聚赖氨酸），将蜡带的反面（注意正反面!）漂浮于其上放入烫板上（42C ）进行展片。蜡 带完全展开后（数分钟至几十分钟不等，注意观察以免展过头，以组织不裂开为度，）吸去 多余的水，用一张镜头纸轻轻压在蜡带上，然后用吸水纸吸去多余的水。置于42C烫板上 干燥过夜。4、切好的片子应尽量在一星期内进行杂交。植物组织 RNA 原位杂交第二部分RNA探针的地高辛标记一、转录模板的线性化要转录的DNA （150-1200bp无polyA尾）被克隆在合适转录载体的多克隆位点上，多克隆 位点的外端带有SP6、T7或T3 RNA多聚酶的启动子，女如）SK、pKS、pGEM-T和pSPT18或19。转录反应开始之前必须将DNA模板在插入序列的一端进行酶切为防止转录岀非目的的RNA, 应选用产生5端凸出（或平端？）的内切酶，酶切必须完全。酶切时要同时制备正义和反义 DNA模板。酶切体系： 总体积200 ulH2O152 或 172 ul210XBuffer20ul10XBSA0 或 20 ul质粒（1ug/ul）6ul酶（10 u/ul）6ulRNase（10mg/ml）6ul1、质粒终浓度为0.1ug/ul，加入合适的内切酶及缓冲液（200 ul酶切体系），在 合适的温度下保温（如37C, 2小时），电泳检查是否酶切完全。酶切后可以加 入等体积的水（200 ul）,这样可以减少后面抽提时的损失（注意：此时应该以 混合后的体积作为 1 倍体积）将 3M 的醋酸钠取出化冻2、 酶切后，加入等体积的酚（Tris饱和的酚pH 7.8,下层溶液才是酚）（200ul）： 氯仿（200 ul）（先加酚，振荡，再加氯仿，振荡）抽提，12000转/分离心，5 min，取上清夜（弃下层有机相）到EP管中。再加等体积的氯仿（400 ul）抽 提，12000转/分离心，5 min，取上清夜（弃下层有机相）到EP管中。再重复 一次氯仿抽提，取上清。3、 在上述水相中加入3M的醋酸钠（中和磷酸基团，有助于沉淀DNA），使终浓度 达到0.3M （由最后所得的上清液的体积决定）。约1分半以后再加入2倍冰预 冷的乙醇，置冰上1小时（推荐是-20C过夜）。4、 样品取出，12000g离心，10 min。弃上清，加400 ul 70%乙醇，颠倒混匀后再 12000rpm离心10 min。把残液吸尽后，真空干燥（约1.5 min），重悬于水或 1/10 TE （pH 8.0）溶液中使终浓度达0.5-1ug/ul （视最初的质粒浓度来决定 应加TE的体积），-20C保存。二、RNA探针的标记下午开始做，先将Buffer, DDT, ATP, GTP, CTP和Dig-UTP化冻，不同公司用各自的一套 反应体系。1、 标记反应体系：（室温下，以 T7 RNA 聚合酶为例。）宝丽曼反应体系10 ulDEPC 水（要根据模板加样量决定）2.5ul10XT7转录缓冲液0.5ulRNA酶抑制剂（50u/ul）2.5ul5mM ATP2.5ul5mM GTP2.5ul5mM CTP2.5ul1mM DIG-UTP1 ulDNA线性模板（0.5-lug）1 ulT7 RNA 聚合酶Total:25 ulPromega的反应体系4-5ulDEPC 水（要根据模板加样量决定）5 ul5XT7转录缓冲液2.5ulDDT(100mM)2.5ul5mM ATP2.5ul5mM GTP2.5ul5mM CTP2.5ul1mM DIG-UTP1-2ulDNA线性模板（0.5-lug，视模板浓度而定加样体积）0.5ulRNA酶抑制剂(40u/ul)1 ulT7 RNA 聚合酶(20u/ul)Total:25 ulTakara的反应体系4.5ulDEPC 水（要根据模板加样量决定）2.5ul10X SP6 转录缓冲液2.5ulDDT(100mM)2.5ul0.1%BSA2.5ul5mM ATP2.5ul5mM GTP2.5ul5mM CTP2.5ul1mM DIG-UTP1.0ulDNA线性模板（0.05-0.5ug,视模板浓度而定加样体积）0.6ulRNA酶抑制剂(40u/ul)1.0ulSP RNA 聚合酶(10-50u/ul)6Total:25 ul此时将t RNA（100mg/ml和3.8 M Nrc拿出来化冻并混匀。2、37C温育2小时（此时可跑胶检测转录产物的长度，但多省略）。3、终止转录反应：75 ul 1xMS2ul tRNA（100mg/ml）（Sigma, R4251,500 units, Type XXI,Ribonucleic acid, transfer,放在-20C 的 EP 管；它在万一有 RNAase 的情况下，则可以保护转录的RNA,牺牲自己去被降解；而且在沉淀的 时候可以与合成的RNA共沉淀，尤其在合成的RNA量很少的情况下可以 减少损失）1 ulDNA 酶（无 RNA 酶污染的 DNaseI（10u/ul）4、37C温育10分钟。5、沉淀：lOOul 3.8 M NH Ac （可增加离子浓度）46OOul 乙醇（冰上预冷）6、-20C过夜。（或在干冰上10分钟，时间稍微长点没关系）。配好明天用的70%乙醇/0.15M NaCI溶液，体积视标记的数量而定，于。C冰箱存放。 早上过来先打开离心机和冷井制冷，同时打开0C水浴。7、 样品取出，4C 13000-15000转/分（F2402转头），离心10分钟，弃上清。8、用 200ul 冰预冷的 70%乙醇/0.15M NaC