YUNNAN NORMAL UNIVERSITY本科学生综合性实验报告学号： 124120469姓 名：朱曦鉴学院：生命科学学院 专业、班级： 12级生物技术实验课程名称：干旱对禾本科植物玉米和燕麦种子活性和小麦幼苗生理生化指标的影响教师：刘娴开课学期： 2014 至 2015 学年 上 学期云南师范大学教务处编印干旱对禾本科植物玉米和燕麦种子活性和小麦幼苗生理生化指标的 影响 摘要：逆境条件如干旱，高温，低温，盐碱等环境因子，能够影响植物生理生 化过程中的各种细胞的活性，通透性，DNA的甲基化，基因的表达酶的合成及活 性，细胞内甾类，酸脂类及植物激素的活性等方面，从而影响植物的整个生理 生化过程。对不同植物逆境胁迫生理生化指标的研究，对该物种在农业上的引 种，驯化，改良及生产过程的中的管理都具有指导意义。本课题通过对干旱和 正常条件下玉米与燕麦种子胚的活性的研究及小麦幼苗叶片中脯氨酸，MDA,过 氧化氢，抗氧化酶，GSH, ASA含量的测定，以探究干旱条件对小麦幼苗的生理 影响。关键词：逆境胁迫 干旱小麦燕麦植物常遭受的有害影响之一是缺水。当植物耗水大于吸水时，组织内水分亏 缺。过度水分亏缺的现象叫干旱张会,植物干旱逆境胁迫研究综述。小麦为旱 地作物，在我国南北方均有种植，是重要粮食作物。干旱对于小麦来说是主要的 逆境胁迫因子。干旱缺水会对小麦的细胞膜通透性，细胞形态，酶活性，光合作 用，渗透作用，细胞内外环境的离子浓度及胞间信号传导产生影响。干旱导致的缺水能够破环细胞膜的结构，使膜蛋白流失，细胞质溶胶和会失 活甚至完全变性，有研究表明生物自由基是伤害细胞膜系统的主要原因，而水分 胁迫造成的膜系统的伤害就是细胞内氧气的产生与清除的不平衡引起的，同时导 致细胞质外渗引起质膜透性(PMP)上升陈洪，2000。SOD、CAT和POD三种酶 系统协调一致，使得植物自由基维持在较低水平，防止自由基对植物细胞的伤害 孙国荣等，2003所以，干旱情况下以上酶系的几种重要酶含量会上升。毕会涛 等研究表明，在干旱胁迫下灰枣 SOD、 CAT、 POD 活性升高，超出忍受范围后 降低，细胞膜受到伤害，通透性、膜脂过氧化产物丙二醛含量均有所增加。在干 旱条件下植物自身通过抗氧化酶类活性的提高及时清除活性氧，减轻膜损伤，而 在重度胁迫条件下，活性氧代谢平衡被破坏，活性氧积累，质膜过氧化加剧。另 外，干旱条件会对植物细胞的形态产生影响，由于缺水导致的细胞皱缩，从而影 响细胞的酶与原料的接触，以及影响保卫细胞形态，降低气孔的气体交换率，导 致呼吸作用效率降低，植物是自养型生物，光合作用的降低会使整个植物体供能， 有氧呼吸等都受到抑制。大量的研究发现 , 在逆境胁迫下 ,植物体内脱落酸 （ABA）和水杨酸（SA）的含量会发生明显的变化，诱导许多新基因的表达及蛋 白质合成。赵虎成,王伯初等，2000。本次试验，我们主要通过对干旱条件下 的小麦和正常生态条件下的小麦进行Pro,MAD,H202,抗氧化酶，谷光氨肽的含 量测定，来讨论小麦唉干旱条件下各项生理生化指标受到的影响，及整个干旱条 件对植物生理状态的影响方式。脯氨酸（Pro）是水溶性最大的氨基酸，据有很高的水和能力，其溶液水势 高,脯氨酸的疏水端可与蛋白质结合,亲水端可与水分子结合,因此,蛋白质可 借助脯氨酸结合更多的水，从而保证蛋白质不会由于缺水而变性。在正常情况下 植物组织内的脯氨酸含量较低，但在干旱条件下，脯氨酸含量会升高，以提供足 够的自由水维持正常生命活动。所以脯氨酸含量是植物干旱条件生理状态变化的 指标之一。丙二醛（MAD）是膜脂过氧化的最终产物，会抑制蛋白质的合成。植物在衰 老和逆境伤害的情况下，会发生膜脂过氧化生成丙二醛。过氧化氢是植物代谢的一种产物，过氧化氢的积累对细胞有氧化破坏作用， 可通过其含量来了解植物组织的破坏程度，是植物逆境的一个指标之一。抗氧化酶是植物体内的一套负责清除活性氧化物的系统，一般情况下，抗氧 化酶的含量在细胞为维持一个较为恒定的状态，但在干旱条件下，抗氧化酶的含 量会增加，抗氧化酶含量可以通过POD和PPO两种途径来测定。谷胱甘肽（GSH）是植物重要的抗氧化剂之一，对细胞起保护作用。 谷胱甘肽，过氧化氢，抗氧化酶，丙二醛，脯氨酸的含量可以通过 分光光 度计测定。另外，逆境条件还会对种子萌发率造成影响。种子在休眠期需要一个干燥高 二氧化碳的条件，但高温等逆境条件会对种子的胚的活性造成不利影响，导致种 子失活。可以用TTC和曙红染色等方法测定种子的活性。1.材料和方法1.1材料本实验所采用的小麦苗由同一品种小麦种子所发，一个干旱处理，一个正常 生长条件生长。干旱条件下的小麦作为实验组，正常生长的小麦作为对照组。 1.2方法1.2.1脯氨酸的吸光值测定分别取O.lg实验组和对照组的小麦叶片，加入3mlSSA和少许石英砂充分研 磨，将全部的研磨物转入离心管，5000rpml离心lOmin，测量上清液；分别取 2ml上清液，分别加入2ml冰乙酸和2ml茚三酮，煮沸15min,冷却后若无杂质 即用分光光度计可测定其A520值。1.2.2丙二醛的吸光值测定分别取01g实验组和对照组，加入3mL 50mM PBS （pH=7.8）和少许石英砂， 充分研磨，用2mL PBS洗研钵，5000 rpm离心10min,测量上清液；分别取上清 液各 2mL，加入 0.6%TBA（用 0.6% TCA 配制）2mL，煮沸 12min,冷却后 5000 rpm 离心10min，分别测定OD450和0D532。1.2.3过氧化氢吸光值测定分别取0.1g实验组和对照组，加入3 mL 50 mM PBS （pH=6.8，内含1mM HA） 和少许石英砂，充分研磨，用2mL PBS洗研钵，5000 rpm离心10 min，测量上 清液；分别取上清液各3mL，加入0.1%Ti（SO4）2 用20%（v/v） H2SO4配制1mL， 摇匀，测定OD410。1.2.4抗氧化酶的测定分别取0.1g实验材料，加入少许石英砂和3ml提取液（50mmol/LPBS, pH5& 内含0.1mmol/ LEDTA, 1%PVP），充分研磨，转入离心管中，用2ml提取液洗 研钵，5000 rpm离心10min，测量上清液。取POD反应混合液（10mmol/L愈创木酚，5mmol/L H2O2，用PBS溶解）3ml， 加入酶液50微升，（空白调零用PBS取代），立即记时，摇匀，读出反应30s 和90s时的A470。取PPO反应混合液（20mmol/L邻苯二酚，用PBS溶解）3ml，加入酶液50 微升（空白调零用PBS取代），立即记时，摇匀，读出反应30s和90s时的A410。以每分钟A值变化0.01所需要的酶液的量为一个活力单位(U)。1.2.5谷胱甘肽吸光值测定分别取0.5g实验组和对照组的胚芽鞘，加入3mL 5%三氯乙酸(TCA)和少 许石英砂，充分研磨，用2mL5% TCA洗研钵，5000rpm离心10min，测量上清液 体积；上清液各 1mL，分别加入 1mL0.1M PBS (pH=7.7), 0.5mL 4mM DTNB (用 0.1M pH6.8PBS现配，空白用此PBS代替)，25C 5min，测定A412值。2.结果及讨论2.1结果2.1.1脯氨酸含量计算V总V显V用A520eLXW含量实验组5.4ml6ml2ml1.5153.240.175.75 umol/gFW)对照组5.6ml6ml2ml0.0993.240.15.13(umol/gFW)PfQ CWhrTl = 城 V X 彳pn已由公式 得出实验组和对照组的脯氨酸含量(见上表)可知干旱状态下脯氨酸的含量明显升高，脯氨酸含量升高可以结合更多的自由 水，以维持植物体的生命。2.1.2丙二醛含量计算实验组上清液体积4.2ml，0D450为0.072, OD532为0.056对照组上清液体积4.9ml，OD450为0.018, OD532为0.015根据 OD450=C1X85.4OD532二C1X 7.4+155000 X C2则 C1 (mmol/L) =11.71XOD450C2 (umol/L) =6.45 XOD532-0.56XOD450其中，C1为可溶性糖浓度，C2为MAD浓度可测的实验组 C1 为 0. 84312 (mmol/L)，C2 为 0.32088 (umol/L)；对照组C1为 0.21078 (mmol/L)，C2 为 0.08667 (umol/L)由结果可知干旱条件下丙二醛浓度是正常情况的3.7倍，干旱会导致植物组织内 丙二醛浓度升高。丙二醛含量的升高会破坏细胞的结构及胞内各类物质遭受破坏 从而导致植物体生长状态较差。实验组可溶性糖含量较对照组高，在干旱条件下, 可溶性糖含量的增加会是细胞渗透式增加，对于维持细胞内水分，植物体细胞膨 压有重要作用。2.1.3过氧化氢含量计算V总V显V用A410eLXW含量实验组6.004.240.7360.280.1165.6对照组6.154.240.0520.280.171.96由公式心 令心说可得出过氧化氢的含量，干旱条件下小麦的过 氧化氢含量变高。2.1.4抗氧化酶POD和PPO活力单位的计算PODV总V显V用A470etXW活力单位实验组4.3ml3ml50ul0.607/1.47026.60.183.7对照组4.3ml3ml50ul0.140/0.22226.60.17.9PPOV总V显V用A410tXW实验组4.3ml3ml50ul0.156/0.2300.010.16364对照组4.3ml3ml50ul0.097/0.1230.010.12236由公式，可得小麦不同条件下的POD酶活力单位，干旱条件下小麦的POD值为83.7，而正常生长的小麦其POD活力单位仅为 7.9，可见干旱对小麦POD酶的影响作用极大。FDutINhb月 乂 总 fUfFWI由公式可得小麦不同条件下的PPO酶活力单位，干旱条件下小麦的PPO值为63.64，而正常生长的小麦其PPO活力单位仅为 22.36，可见干旱对小麦PPO酶的影响作用极大。小麦在干旱条件下，抗氧化酶的含量会升高，以减轻氧化活性物质对组织的损害，保证正常生命活动。2.1.5谷胱甘肽含量计算V总V显V用A412eLXW含量实验组5421.50313.60.111.05对照组6420.11313.60.10.997由公式 一-可得谷胱甘肽在干旱条件和正常生长状态 下小麦内的含量。在干旱胁迫下，谷胱甘肽的值较正常情况下增高，这是因为还原性谷胱甘肽 是生物细胞中含量最丰富的非蛋白质硫醇化合物。在生物体内不同的胁迫响应途 径中，利用谷光氨肽是亲和活性来消除活性氧和重金属等对细胞的伤害。因此， 在生物的氧代谢及抗逆生理中谷胱甘肽发挥着重要的作用。小麦在干旱条件下通 过提高谷光氨肽含量来应激环境变化。在正常供水情况下，小麦不存在干旱胁迫 所带来的伤害，其体内的谷胱甘肽处在正常的代谢中，所以在