基因工程实验设计题目：绿色荧光蛋白基因(gfp)的克隆及表达专业：生工1001姓名：刘会淼2013 年 3 月 13实验目的：研究绿色荧光蛋白(Greed Fluorescent Protein， GFP)基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达。实验方法；通过分别将 DH-5a (pEGFP-N3)和DH-5 o(pET-28a)提取质粒、酶切并连接形成重 组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入E.coli DH-5 a感受态细胞中进行转化，通过限制性核酸 内切酶Not I与Bam H1和PCR对所建质粒进行分析鉴定后,通过转化的方法把含绿色荧光蛋白(GFP)外源基因转入大肠杆菌体BL-21内进行表达，再用IPTG诱导GFP基因表达，如果可以看到显现绿色，判断GFP基因在大肠杆菌中成功表达。1. 材料与方法：1.1.1 实验材料克隆菌E.coli DH-5a、表达菌BL-21为本实验室收藏菌种，质粒pET-28a和pEGFP-N3，引物，限制性内切酶 Bam H1、 Not I1.1.2仪器设备Eppendof离心机、电泳仪、电子天平、台式离心机、控温磁力搅拌器、调温电热套pH计、冰箱、台式冷冻恒温振荡器、紫外灯、生物洁净工作台、电热恒温水温箱、琼脂糖凝胶电泳电泳装置、凝胶成像分析系统、酒精灯、培养皿、移液枪、枪头 、接种环、酒精棉球、灭菌枪头、平板封口膜、离心管1.1.3试剂及溶液分装后于121 C 高压灭菌20 min。(LB固体培养基是在液体 LB中加琼脂粉至1 %)溶液I 50 mL葡萄糖50 mmol/LTris-Cl (pH 8.0)25 mmol/LEDTA (pH 8.0)10 mmol/L121C高压灭菌 15 min后置于04C贮存；溶液 II 100 mLNaOH0.2 mol/LSDS1% (W/V)用时由母液2 mol/L NaOH、10%(W/V) SDS稀释现配；溶液 III 100 mLKOAc (5 mol/L)60 mL冰乙酸11.5 mLH2O28.5 mL121 C高压灭菌 15 min后置于04 C贮存；氯仿；琼脂糖；灭菌的去离子水；10瀚切缓冲液；TaqDNA聚合酶；TaqDNA聚合酶缓冲。灭菌的0.1 mol/L CaCI 2标准相对分子质量的 DNA ；溴乙锭EB)储存液 0.5 g/mL ； LB/Kan，(50 A0/mL )固体培养基；IPTG配成浓度为400 mM水溶液，-20 C保存备用；卡那霉素(Kan)配成浓度为100 ug/mL水溶液，-20 C保存备用；70%乙醇：用新开装的乙醇和灭菌无离子水配成，放在 04 C；无水乙醇 ：放在 04 C； RNase母液：将 RNase溶于10 mmol/LTris CI(pH 7.5)、15 mmol/L NaCI配成的试剂中，配成 10 mg/mL的溶液，在100 C加热15 min，使可能溶有的DNase失活，然后缓慢冷却至室温，分装成小份保存于一20 C；2.方法：1.1.4大肠杆菌DH-5 a(pEGFP-N3)染色体DNA的提取1.1.5、实验目的：掌握酚氯仿法提取DNA的原理和操作。1.1.6，器材：，微量移液器、高速离心机、1.5ml EP管、吸头、烘箱、水浴锅、1.5ml管架、胶头滴管、冰箱，消化缓冲液：CTAB/NaCl溶液：4.1g NaCl溶解于80ml H2 O,缓慢加入 10g CTAB,加水至100ml；其它试剂：氯仿：异戊醇(24:1)，酚：氯仿:异 戊醇(25:24:1)，异丙醇，70% 乙醇，TE，10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml 或粉剂)，5mol/L NaCl o1.1.7实验原理生物的大部分或几乎全部DNA都集中在细胞核或类核中。DNA在体内通常都与蛋白质结合，蛋白质对DNA制品的污染常影响到以后的DNA操作过程，因此需把蛋白质除去，一般采用酚氯仿抽提法。苯酚、氯仿对蛋白质有极强的变性作用，而对DNA无影响。经苯酚、氯仿抽提后，蛋白质变性而被离心沉降到酚相与水相的界面，DNA则留在水相，少量的或与DNA紧密结合的蛋白质可用蛋白酶予以去除。DNA制品中少量的 RNA无影响，必要时可加入不含 DNase的RNase去除RNA污染。1.1.8、实验步骤1. 100ml细菌过夜培养液，5000rpm离心10分钟，去上清液。2. 力口 9.5ml TE 悬浮沉淀，并加 0.5ml 10% SDS, 50“l20mg/ml(或 1mg 干粉)蛋白酶K,混匀，37C保温1小时。3. 力口 1.5ml 5mol/L NaCl,混匀。4. 加1.5ml CTAB/NaCl溶液，混匀，65 C保温20分钟。5. 用等体积酚：氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提,5000rpm离心10分钟，将上清液移至干净离心管。3. 用等体积氯仿 :异戊醇 (24:1)抽提, 取上清液移至干净管中。7、 力口 1/10体积3mol/L NaAc，及2 .5倍体积预冷(一2 0C )无水乙醇，混匀。2 0 U 沉淀 3 0 min。12000rpm15min，弃上清8、 力口 70%乙醇1ml,轻轻混匀，12000rpm15min，弃上清。9、EP管放置于烘箱中烘干。10、加3 0 ul TE 或 ddH2O 溶解DNA。11 、琼脂糖凝胶电泳检测 注意，实验室中一般用的 1.5ml 的 EP 管，可根据自己需要按比例调节加样量。DH-5 a(pET-28a)的载体质粒也可根据同样方法提取。1.1.9PCR 扩增1.1.10 实验目的1、学习PCR扩增的基本原理。2、掌握PCR技术的常规操作。3、了解PCR扩增的参数设计。1.1.11 实验原理1、聚合酶链反应(Polymerase chain reaction， PCR):利用核酸变、复性的性质，以待扩增的DNA为模板，在体外由引物介导的酶促合成特异DNA片段的过程。2、PCR反应体系引物、 dNTP 、 Mg 2 、模板、 Taq DNA 聚合酶， Buffer 。3、PCR循环参数9 5 C5min9 5 C30s52 C30s72C 30sgoto 2 9 times72C10min1.1.12 器材1 ，微量移液取样器，移液器吸头， 0.2ml PCR 微量离心管， PCR 仪，台式离心机，琼脂 糖凝胶电泳系统，紫外凝胶成像系统2，Taq DNA聚合酶，PCR缓冲液，MgCl2，dNTP，引物，模板，ddH2O，TBE电泳缓冲液，EB,加样缓冲液3，引物：1.1.13 实验步骤1、在 0.2ml PCR 微量离心管中配制30ul 反应体系。dd water10.5ul10 x PCR buffer （不含 MgCl2 ）3ul25mM MgCl22ul10mmol/L dNTP1ul10 “ mol/L 引物 11ul10“ mol/L 引物 21ul模板1ulTaq 酶0.5ul总体积 20ul2、在离心机中混匀。3、EP管放入PCR仪中，按照原理中的条件设置程序，进行PCR反应。4、PCR结束后，取3ul PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测4. 凝胶电泳法回收目的 DNA 及其体外连接1.1.14、实验目的6. 学习和掌握从琼脂糖凝胶中回收 DNA 片段的方法。7. 掌握 DNA 体外连接的方法。1.1.15，实验原理1， DNA 分子在琼脂糖凝胶中的电泳速率与以下因素有关：DNA 分子大小DNA 分子构象琼脂糖凝胶浓度 电泳所用电压电泳缓冲液2. 利用硅胶膜在高盐浓度时能特异性吸附 DNA ，而在低盐浓度时可使 DNA 被洗脱的原 理纯化 DNA 。3. Taq酶参与PCR反应中，产物双链核酸中的 3端各多连接一个脱氧腺苷酸 A，与商业 开发的 pMD18-T 载体可在 DNA 连接酶作用下，按照碱基配对形成环状的完整质粒。1.1.16，仪器1,凝胶电泳系统，刀片，紫外仪，酒精灯，1.5ml EP管，1.5ml EP管架，65C水浴锅2，PCR产物，1x TBE，加样缓冲液，TakaRa胶回收试剂盒，TA克隆试剂盒，DL2000 marker1.1.17，实验步骤1， 2%琼脂糖凝胶电泳2，在紫外灯下用干净的手术刀割下含有目的DNA 琼脂糖块装在 1.5ml 的 EP 管中称量减 1 克即为凝胶块重量3，加入5个凝胶体积量的 DR-I Buffer4，混匀65 C加热融化凝胶块5，加入DR-I Buffer量的1/2体积的DR-II Buffer,当目的片段小于 400bp再加入终浓 度为 20% 的异丙醇6，将上述溶液 short 后转移至 spin coloumn 中 12000rpm, 1min 弃滤液7，加入 500ul RinseA 12000rpm 30s 弃滤液8，加入 700ul RinseB 12000rpm 30s 弃滤液9，同 810，将 spin coloumn 安置于新的 1.5ml EP 管中 在 spin coloumn 膜中央加 25ulElution Buffer 放入烘箱 1min 12000rpm 1min 保存 1.5ml EP 管 1%胶检测11 ，链接反应（冰上操作）在一支 0.2 ml EP 管中加入以下试剂： 纯化的目的 DNA 片段4.5ulVector0.5ul连接液5ul5. DH-5 a和BL-21感受态细胞的制备1）将04 C保存的DH-5 a和BL-21菌种分别接种在LB液体培养基中37 C下250 r/min过夜 培养16 h。2）将分别接种过夜菌：LB按1:50的比例接种于2 mL的LB液体培养基中，37 C活化培养23 h 至 OD=0.3 0.5。3）取1.5 mL菌液转入EP管中，置于冰上 10 min,然后于4 C下5000 r/min离心5 min。弃 上清液，沉淀加入0.1 mL预冷的0.1 mol/L CaCI 2缓和悬菌。冰上放置15-30 min后，4 C 下 5000 r/min 离心 10 min。4）弃上清液，沉淀用0.1 mL预冷的0.1 mol/L CaCl 2 （含15%甘油）缓和悬菌，放在一20 C 冰箱内保存。6. 感受态细胞的转化1）取制备好的感受态细胞100 “，冰上解冻，均匀悬浮。2）加入2 “酶连产物，轻轻混匀，冰上静置10-30 min。3）42 C水浴中热击70 sec后，冰上放置 2 min。4）加入200 “ LB液体培养基，37 C，50-100 rpm振荡培养1 h。5）取200 “悬浮细胞涂布在含合适抗生素的LB固体培养基上，用涂布器均匀涂布，平皿正放静置1-2 h后，封口膜封好平皿，37 C培养倒置12-16 h。7. 碱法提质粒1）用灭菌吸头挑取单菌落，浸没于 2 mL含有抗生素的LB液体培养基中，37 C , 180 r/min 振荡培养过夜。2）取1.5 ml培养物倒入微量离心管中，用微量离心机于4 C、11000 r/min离心1分