固有免疫系统在铜绿假单胞菌肺部感染中的作用背景与目的： 铜绿假单胞菌肺部感染是医院感染死亡的主要原因之一。 作为 机会致病菌， 铜绿假单胞菌可以根据环境改变自身基因表达， 具有极强的适应能 力和适时多变的毒力， 通过与宿主免疫系统相互作用、 相互调节共同决定着感染 的结局。肺固有免疫系统在铜绿假单胞菌感染中起着重要作用， 对其机制的深入研究 对临床工作有指导意义。为此，本文拟从分子水平、细胞水平、器官水平研究不 同状态下同一株铜绿假单胞菌引起感染时宿主固有免疫系统(TLRs和N0D2的变化和功能，为临床诊断和治疗提供理论依据。方法：1、本研究采用铜绿假单胞菌 ATCC 27853通过LB液体培养基培养法 和体外改良平板培养法分别建立浮游菌和生物被膜菌。 分别用这两种状态下的菌 株作用于人呼吸道上皮细胞株 A549 HBE构建体外感染模型。采用 RT-PCR和 Western blot 方法检测 TLR2 TLR4 TLR5和 N0D2勺表达、 ELISA法检测细胞上清中IL-6、IL-8水平，应用Western blot方法测定浮游菌 感染模型中TRAF6 NF-k B蛋白表达量。2、采用分别处于上述两种状态的菌株 建立大鼠铜绿假单胞菌肺部感染模型，按随机原则将66只SD大鼠分为对照组、浮游菌感染组、生物被膜菌感染组。分别于浮游菌感染组建模后4h、1d、3d,生物被膜菌感染组建模后4h、7d、 14d 采集标本，进行肺组织病理形态学观察，采用 RT-PCR、 Western blot 法检 测肺组织TLR2 TLR4 TLR5和NOD2的表达。3、浮游菌作用A549细胞4h后， 提取细胞上清中的分泌蛋白进行双向凝胶电泳， 寻找表达差异显著的蛋白点进行 质谱鉴定。结果：1、体外感染模型中，TLR2的表达无明显差异(P 0.05) ; TLR4在浮游菌和被膜菌感染4h组表达上调(P V 0.05) , TLR5mRN水平在浮游菌作用的 15min即发生明显上调，至作用30min组升至最高点，随后有下降趋势(P V 0.05);TRAF6和NF-k B与TLR5的表达情况基本一致。IL-6、IL-8水平随着作用时间的 延长逐渐上调 (PV0.05)。2、动物感染模型中，浮游菌感染组和被膜菌感染组的病理变化差异明显。浮游菌感染组中，TLR2的表达无明显差异(P 0.05) ; TLR4的表达在3d组中上 调(P V 0.05) ; TLR5水平在4h组显著增高以后逐渐下调(P V 0.05) ; NOD2勺表达 在 4h 组上调后恢复正常 (PV 0.05) 。生物被膜菌感染组中，TLR2 TLR5 NOD2勺表达逐渐增高(P V 0.05)，TLR4 的表达在d14组明显增高(P V 0.05) o 3、获得了分辨率和重复性较好的双向凝胶 电泳图谱，取对照组和浮游菌处理组中表达差异显著的蛋白质点进行肽质指纹分 析，经数据库查询， 表达差异显著的蛋白可能为 Notchless protein homolog 1， 其功能尚未阐明。结论： 1、处于不同状态下的同一菌株引起感染的病程和结局不同，铜绿假 单胞菌根据外环境调节自身状态在机会感染中有重要意义2、不是 TLR2TLR4而是鞭毛蛋白结合TLR5介导的MyD8yTRAFNF-k B信号通路在铜绿假单胞菌 感染初始阶段起主要作用 3、在铜绿假单胞菌慢性感染中肺固有免疫系统被充分激活