能够结合在双链首先我们得来说说染料法SYBR GreenSYBR Green的原理，DNA上面的荧光染料，只有结合了双链DNA，才会发荧光，而游离的不会发光。 图1 SYBR Green原理 但是，染料没有选择特异性，就是只要有双链DNA，就会染上，并发荧光。 如果使用的引物产生了非特异性扩增，那么荧光强度就不是目的条带真实的强度，扩增的都是目的片段qPCR我们如何判断本次 因此会产生严重偏差。融解曲线循环反应结束之后，系统会进行测定融qPCR 在呢？这就需要用到融解曲线。解曲线，通常的方式就是从70度加热到90度，然后每隔一定时间（1s或者少于1s）测定系统荧光强度，随着温度的升高，dsDNA都解开双链，SYBR Green都游离之后不发荧光，荧光逐渐下降。那么画出来一个个荧光强度和温度的曲线： 图2 融解曲线 然后我们运用医学中学到的高等数学C的求导，把荧光强度对温度求导，得出 下图 融解曲线的求导图3 为什么中间的峰那么高？ dR/dT 越大，表明荧光值变化最快。随着温度上升，达到图中Tm点时，大部分扩增出来的双链DNA解开，荧光值下降非常快。如果qPCR产物非常特异那么，融解曲线在80-90之间会形成一个单峰(温度和qPCR产物长度以及GC含量相关)。 但是除了单峰还会出现什么样的情况呢？ 请看下面两个示意图 图4 前置杂峰 后置杂峰图5