60Co射线照射对肺泡II型细胞和肺泡隔间质细胞的生物效应 作者：刁瑞英, 宋良文, 王少霞, 李明【摘要】 目的: 探讨60Co射线照射对肺泡II型细胞和肺泡隔间质细胞的生物效应。方法: 原代分离肺内II型上皮细胞(AT)和间质细胞包括巨噬细胞和成纤维细胞, 分别进行0、 3、 5、 7 Gy的射线照射, 用细胞核嗜银染色观察照射对AT增殖的影响; 用酶谱分析检测照射后AT和间质细胞培养上清中基质金属蛋白酶2、 9的活性; 用ELISA检测间质细胞培养上清中TGF1和IV型胶原含量。结果: AT的核仁数量随照射剂量增加而增多, 其中7 Gy组最高; ATII培养上清中MMP2、 9活性随照射剂量增加呈先增高后降低趋势, 间质细胞上清中MMP2、 9活性和TGF1水平逐渐升高, IV型胶原分泌水平呈先降低后升高趋势。结论: 放射性肺损伤早期, AT、 巨噬细胞和成纤维细胞均参与肺组织无效性重建过程, 与晚期肺纤维化启动有一定的内在联系。【关键词】 肺泡II型上皮细胞 间质细胞 MMPs TGF 1 IV型胶原Abstract AIM: To explore the biological effect of 60Co ray on alveolar type cells and interstitial cells of alveoliar septum. METHODS: Alveolar type cellsand interstitial cells including interstitial macrophages and fibroblasts were irradiated by 0, 3, 5, 7 Gy of ray respectively. The effect of irradiation on AT proliferation was observed by argentation against nucleus. The activity of MMP2, 9 in supernatants from AT and interstitial cells after irradiation was determined by zymography. The levels of TGF1 and collagen type IV in supernatant from interstitial cells after irradiation were measured by ELISA. RESULTS: The nucleolus number of AT was increased with the increase of irradiation dose and group 7 Gy reached the highest level. The activity of MMP2, 9 in supernatant from AT after irradiation increased at first and then decreased gradually. The activity of MMP2, 9 and the content of TGF1 in interstitial cells increased step by step, but collagen type IV decreased at first and then increased. CONCLUSION: AT, macrophages and fibroblasts are all involved in pulmonary invalid remodeling course in early radiation pulmonary injury, which is related to the initiation of pulmonary fibrosis in late period.Keywordsalveolar type cell; interstitial cell; MMPs; TGF1; collagen type IV放射性肺损伤和肺纤维化为临床常见并发症, 其发生机制尚未完全明了, 因此有效防治较为困难1。肺损伤早期的形态学改变主要是肺泡基底膜型胶原降解, 继发引起成纤维细胞增生及型胶原再度增多, 常导致肺重建发生。基质中IV型胶原合成和降解平衡失调可能与晚期肺纤维化的启动有关。基质金属蛋白酶2和9(Matrix metalloproteinase2, 9, MMP2, 9)是IV型胶原特异性降解酶。多种细胞参与了肺损伤重建过程, 其中肺泡II型细胞和肺泡隔间质细胞在肺损伤重建和纤维化发生中起重要作用。本研究拟原代分离上述细胞, 探讨60Co射线对肺内细胞的生物学效应以及在早期肺损伤重建中的作用, 揭示放射性肺损伤与肺纤维化之间的内在联系。1 材料和方法材料 Wistar大鼠由军事医学科学院动物中心提供; 新生小牛血清购于杭州四季青生物工程研究所; RPMI1640培养基、 DNase、 大鼠IgG、 Triton X100购于Sigma公司; 小鼠抗人型胶原单克隆抗体(mAb)购于北京中杉金桥生物科技有限公司; 兔抗大鼠TGF1多克隆抗体购于博士德公司。方法AT和间质细胞原代分离 参照Dobbs等的方法,g/L胰蛋白酶消化和剪碎肺组织, 将细胞悬液加入大鼠IgG包被的培养瓶, 37孵育3 h, 贴壁细胞为巨噬细胞和Fb混合体, 将漂浮细胞离心8 min获得AT。锇酸染色鉴定AT。细胞处理 将接种AT的培养瓶随机分为 0、 3、 5、 7 Gy4 组, 每组3瓶, 分别进行射线照射, 继续培养48 h后收集上清, 4 3000 r/min离心10 min, 同时制备细胞爬片。间质细胞的处理同上。照射后AT的增殖分析 爬片入水, 将染液滴于其上1 h, 封片后图像分析, 在400倍下每组取10个视野, 测定每个视野的颗粒个数及颗粒面积, 求出平均吸光度值。培养上清MMP2、 9活性检测 参照文献, 将AT和间质细胞上清进行SDSPAGE电泳、 洗脱、 漂洗、 孵育、 染色及脱色, 成像分析条带面积和灰度; MMP2、 9活性条带面积。间质细胞上清TGF1和IV型胶原测定 (1)TGF1: 上清倍比稀释, 双平行孔, 37 2 h, BSA 37封闭2 h, TGF1多克隆抗体 (150) 37 30 min, HRP标记的羊抗兔IgG (110000) 37 30 min, TMB 37显色15 min, 2 mmol/L硫酸终止反应; 在450 nm处检测吸光度A值; (2)IV型胶原: 同上, 一抗为小鼠抗型胶原mAb, 二抗为HRP标记的羊抗小鼠IgG。统计学处理 应用统计软件进行数据处理, 平均吸光度A值以xs表示, 组间差异比较采用t检验。2 结果AT分离和鉴定 每只大鼠可分离2107 AT, 锇酸染色显示胞质内含有嗜锇板层小体, 细胞纯度85%。照射对AT增殖的影响 照射后AT内核仁增多, 其中3、 5及7 Gy组的平均A值较0 Gy组分别增加了%、 % 及%, 7 Gy组核仁增多最明显。图1 照射后AT核仁的相对含量Fig 1 Nucleolus number of AT after irradiation (Argentation),vs 0 Gy group.细胞上清MMP2、 9活性 (1)在AT上清中, 3和5 Gy组MMP2活性较0 Gy组分别增加%、 %, 7 Gy组较0 Gy组降低%; 3、 5及7 Gy组MMP9活性较0 Gy组分别增加%、 %和% 。 (2)在间质细胞上清中, 3、 5和7 Gy组MMP2活性较0 Gy组分别增加%、 %和%; MMP9活性较0 Gy组分别增加%、 %及%。图2 照后AT和间质细胞上清MMP2、 9活性(图像分析)Fig 2 Activities of MMP2, 9 in supernatant from AT(A) and interstitial cells(B) after irraidiation,vs 0 Gy group.间质细胞上清TGF1含量 照射后上清中TGF1含量出现不同程度的增高, 其中3、 5及7 Gy组较0 Gy组分别增高2%、 %及%, 5和7 Gy组均具有统计学意义 (图3)。图3 间质细胞上清TGF1含量Fig 3 The level of TGF1 in supernatant from interstitial cells,vs 0 Gy group.间质细胞上清IV型胶原含量 上清中IV型胶原含量随照射剂量增加呈先降低后增高趋势, 其中3和5 Gy组较0 Gy组分别降低%和%(), 而7 Gy组较0和5 Gy组增加了%()和100% (), 均具有统计学意义(图4)。图4 间质细胞上清IV型胶原含量变化Fig 4 The level of collagen type IV in supernatant from interstitial cells,vs 0 Gy group.3 讨论 肺内AM和Fb胞膜表面含有IgG的Fc段受体, 能与IgG的Fc段结合, 而AT表面则缺乏Fc段受体。根据这一原理, 本实验采用免疫黏附选择法, 将原代肺组织细胞悬液培养于被覆IgG的平皿中, 有Fc段受体的AM和Fb被黏附贴壁, 而无Fc段受体的AT得以分离, 可分别获得II型细胞和肺泡壁间质细胞用于放射性肺损伤机制探索。AT作为肺泡壁重要的结构细胞,能修复受损的肺泡I型上皮, 合成基底膜物质和IV型胶原。AT向肺泡I型上皮的转化过程是由TGF 1通过Smad信号转导途径介导的。AT的增殖与凋亡在急性肺损伤和放射性肺纤维化的发生中至关重要。有实验表明, 在博来霉素致肺纤维化早期, AT中MMP2基因转录明显上调。ATII还可产生MMP9, 后者与MMP2共同参与受损肺组织重建过程。ATII在放射性肺损伤中对照射的反应尚不完全清楚, 本实验通过细胞核嗜银蛋白染色分析发现, AT的核仁随照射剂量增加而增多, 这与对大鼠单侧胸部照射致肺纤维化模型的病理变化相一致, 表明射线照射能促进肺泡ATII异常增殖。明胶酶谱分析发现, 小剂量射线照射后, ATII中MMP2、 9的酶活性明显增高, 但随照射剂量增加呈逐渐下降趋势, 甚至低于正常对照水平。提示一定范围剂量的照射能促进ATII异常增生和MMPs的合成, 但剂量偏高时抑制MMP2和MMP9的合成与释放, 影响对肺泡隔过多IV型胶原的降解作用, 易于启动肺组织重建的发生。目前关于IV型胶原降解对肺纤维化发生的作用仍有争议。有研究认为, 明胶酶降解基底膜IV型胶原容易使AT与肺泡隔Fb直接接触, 产生细胞间的某种信号转导, 可促进AT和Fb进一步活化和增殖10。有研究报道, Fb产生的HGF和角质细胞生长因子是AT最有效的有丝分裂原11。提示AT与Fb之间的信息交流在肺纤维化启动中可能具有一定作用。 TGF1可通过调控Fb的细胞周期促进其增殖, 参与放射性肺损伤的发生发展, 该效